论文部分内容阅读
目的：利用干扰RNA技术构建CDK2干扰RNA真核表达载体并稳定转染人肝癌HepG2细胞来抑制CDK2的表达，观察CDK2表达受抑制后的人肝癌细胞株HepG2细胞生物学活性及运用双向电泳-图像分析-质谱技术研究亚细胞结构蛋白质组的改变，探讨CDK2在肝癌细胞增殖中的作用，为肝癌的发生、发展的研究及诊断与治疗提供有价值的资料。
方法：1.构建CDK2干扰RNA真核表达载体PGenseil-1-CDK2，电泳及测序鉴定。2.脂质体法转染pGenesil-1-CDK2到肝癌HepG2细胞株，G418筛选阳性转染细胞克隆，制备稳定转染PGenesil-1-CDK2的HepG2细胞系。3.检测获得的稳定转染细胞系细胞生长曲线、细胞周期的改变。4.通过RT-PCR比较转染前后CDK2 mRNA的表达。5.双向凝胶电泳-质谱技术-数据库搜索，比较转染前后细胞浆与细胞核蛋白质组的变化。
结果：(1).成功构建了CDK2干扰RNA真核表达载体。经鉴定证实，构建的siRNAs序列与基因库中序列完全相同，并且未发现有突变、缺失、插入等异常存在。(2)获得稳定转染PGenesil-1-CDK2的HepG2细胞系，命名为PCDNA-siRNA-HepG2。(3).与转染空质粒组的PHK-siRNA-HepG2细胞和未转染组的HepG2细胞相比，PCDNA-siRNA-HepG2组细胞的生长速度减慢，G1期细胞增多，G2/M和S期细胞减少。(4).与空质粒组细胞和空白对照组细胞相比，稳定转染CDK2 RNAi组细胞的CDK2 mRNA表达水平显著下降。(5).通过双向电泳-图像分析-质谱技术得到12个差异表达的蛋白。稳定转染CDK2 RNAi后，细胞核与细胞浆未见表达的蛋白质各4个，包括核糖体S12类似物，微管蛋白等蛋白质，细胞核与细胞浆三倍以上差异的蛋白质各2个。
结论：(1).成功建立稳定转染CDK2干扰RNA的人肝癌HepG2细胞系。(2).CDK2干扰RNA可明显降低HepG2细胞CDK2mRNA的表达，抑制HepG2细胞的增殖。(3).质谱鉴定得到的这些差异表达的蛋白质涉及到细胞周期进展、细胞的增殖、分化及细胞凋亡的信号转导调节、正常细胞的恶性转化及发育调控以及肿瘤的发生、发展和耐药性形成。