肿瘤是一种细胞周期调控紊乱性疾病,其根本原因在于细胞的正性因子表达增强或负性因子表达减弱,导致细胞过度增殖、分裂,出现细胞生长失控。泛素蛋白酶体途径通过降解细胞周期调控因子参与对细胞周期的调控,在平衡细胞周期调控因子方面发挥着重要调节作用,与肿瘤的发生、发展密切相关。S期相关蛋白激酶2(S-phase kinase-associated protein 2, Skp2)属于泛素蛋白酶体系统的组成部分,通过其特异性接触将各种底物蛋白招募到泛素蛋白酶体进行泛素化降解而参与细胞周期的调控。Skp2作为一种与细胞周期调控关系密切的癌基因,参与调控抑癌基因p27kip1的表达。p27kip1是Cip/Kip家族(CDK-interacting protein/kinase inhibition protein)中的一员,是细胞周期的负性调控因子,能阻滞细胞周期于G1期。Skp2和p27kip1通过影响白血病细胞的增殖、分化、凋亡参与白血病的进程和预后。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是目前最有效的基因沉默技术,能特异性抑制靶基因的转录,进而下调相应蛋白水平及功能。为此,我们采用RNAi技术,以Skp2为切入点,构建了靶向Skp2的RNAi序列,在脂质体介导下将干扰质粒瞬时转染K562细胞,研究Skp2基因水平下调后,白血病细胞株K562中p27kip1的表达情况,初步探讨下调Skp2基因表达对白血病细胞增殖和凋亡的影响。实验内容包括以下两部分:第一部分:靶向Skp2特异性RNA干扰重组体的构建及筛选目的:利用pGenesil1.1质粒构建靶向Skp2的短发卡RNA(short hairpin RNA, shRNA)干扰重组体,并通过转染K562细胞筛选有效的干扰序列。方法:利用在线设计软件,分别设计三对针对Skp2的有短发卡结构的DNA序列及一对非特异对照序列,经退火成互补双链,再克隆至带有U6启动子及增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorecence Protein, EGFP)的质粒pGenesil1.1中,构建重组体,转化大肠杆菌菌株DH5α,提取质粒进行酶切鉴定后,进行测序分析。在脂质体介导下,将构建成功的4组重组体转染白血病细胞系K562。采用荧光显微镜及流式细胞仪分析转染效果;通过RT-PCR技术检测各处理组Skp2 mRNA的变化,流式细胞法检测Skp2蛋白表达情况,筛选出有效抑制Skp2表达的序列。实验分7组:①空白对照组(简写为CON组) ;②脂质体lipofectamineTM2000转染试剂组(简写为LIP组);③质粒对照组(简写为KB组);④阴性对照组pGenesil1.1-NC shRNA(简写为NC组);⑤pGenesil1.1-Skp2 shRNA1质粒组(简写为shRNA1组);⑥pGenesil1.1-Skp2 shRNA2质粒组(简写为shRNA2组);⑦pGenesil1.1-Skp2 shRNA3质粒组(简写为shRNA3组)。结果:①酶切测序分析结果表明已成功构建了能表达Skp2 shRNA的三组重组体pGenesil1.1-Skp2 shRNA及阴性对照pGenesil1.1-NC shRNA;②转染后48h,利用荧光显微镜及流式细胞仪证实转染成功,转染效率约40%;③Skp2 shRNA下调Skp2 mRNA的表达:根据实验结果,选取Skp2 shRNA下调率最高的时间点,即转染后48h,收集各处理组的K562细胞测定Skp2基因和蛋白表达水平。RT-PCR结果显示,CON组、NC组、LIP组及KB组之间Skp2 mRNA表达无明显差异,Skp2 shRNA组Skp2 mRNA较NC组均显著降低,其中shRNA1组下调率为40.00%,shRNA2组下调率为76.36%,shRNA3组下调率为56.36%;④Skp2 shRNA抑制Skp2蛋白表达:流式细胞仪分析,CON组、NC组、LIP组及KB组之间Skp2蛋白表达无明显差异,shRNA组Skp2蛋白表达较NC组均显著降低,shRNA1组下调率为36.77%,shRNA2组下调率为67.25%,shRNA3组下调率为45.30%。Skp2 shRNA可显著下调Skp2基因和蛋白的表达,故选取pGenesil1.1-Skp2 shRNA2进行后续实验。结论:利用质粒载体pGenesil1.1可成功构建Skp2的shRNA干扰重组体,且可成功转染入K562细胞,其中pGenesil1.1-Skp2 shRNA2对Skp2的抑制效率较高。第二部分:Skp2短发卡RNA干扰重组体对K562细胞增殖和凋亡的影响目的:应用Skp2 shRNA质粒转染K562细胞,探讨特异性阻断Skp2表达对K562细胞增殖和凋亡的影响。方法:应用体外细胞培养技术,采用RT-PCR技术检测Skp2 mRNA、p27kip1 mRNA水平变化,流式细胞技术检测转染前后Skp2、p27kip1蛋白表达情况;采用显微镜观察细胞的生长情况;采用四甲基偶氮唑蓝(methyl-thiazolyl-tetrazolium,MTT)实验了解细胞增殖抑制情况;采用碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)单染法了解转染前后细胞周期及细胞凋亡率的改变。结果:①Skp2 shRNA抑制Skp2 mRNA表达:RT-PCR结果显示Skp2 shRNA可显著下调Skp2 mRNA的表达,且对Skp2 mRNA的下调从干扰后12h即出现,最高下调率出现在干扰后48h,为76.36%,但Skp2 shRNA瞬时转染对Skp2 mRNA的下调持续时间较短,72h后Skp2 mRNA水平有所回升;②Skp2 shRNA抑制Skp2蛋白表达:流式细胞技术检测结果显示,Skp2 shRNA可显著下调Skp2蛋白的表达,但出现蛋白下调的时间稍晚于Skp2 mRNA,最高下调率出现在干扰后48h,为67.25%,72h后蛋白表达有所回升;③Skp2 shRNA影响p27kip1表达:流式细胞技术检测结果显示,CON组、LIP组、KB组和NC组之间p27kip1蛋白表达无明显差异,Skp2 shRNA组p27kip1蛋白表达较NC组明显上调(591.03±2.60 vs 358.56±10.41),有统计学意义,最高上调率出现在转染后48h,为64.83%,转染后72h p27kip1蛋白表达有所下调,并且p27kip1蛋白的表达与Skp2蛋白表达呈负相关(r=-0.969,P=0.000)。RT-PCR结果显示,各组间的p27kip1 mRNA表达无明显变化。以上说明在转录后水平调节p27kip1的表达;④Skp2 shRNA影响K562细胞周期分布:根据以上结果,选取Skp2蛋白下调率最高的时间点,即干扰后48h进行细胞周期分布、细胞抑制率和细胞凋亡率的检测。碘化丙啶单染法检测表明,CON组、LIP组、KB组及NC组之间细胞周期分布基本一致,Skp2 shRNA组较NC组G0/G1期细胞所占比例增多(64.57±2.36% vs 34.58±0.75%),S期细胞所占比例减少(29.78±4.92% vs 47.65±1.85%),G2/M期细胞所占比例减少(5.65±3.03% vs 17.40±1.01%),均有统计学意义;⑤Skp2 shRNA抑制K562细胞增殖:MTT实验表明,CON组、LIP组、KB组及NC组之间细胞抑制率无显著差异,Skp2 shRNA组细胞抑制率较NC组显著增高(85.43±2.83% vs 1.23±6.51%),有统计学意义;⑥Skp2 shRNA促进K562细胞凋亡:碘化丙啶单染法检测表明,CON组、LIP组、KB组及NC组之间凋亡率无明显差异,Skp2 shRNA组细胞凋亡率较NC组显著增高(12.46±4.35% vs 0.34±0.08%),有统计学意义,并且shRNA组在G0/G1峰之前出现一个亚二倍体峰位-凋亡峰。结论:在脂质体转染试剂介导下瞬时转染Skp2 shRNA质粒,可在转录和翻译水平下调Skp2表达,并且可以抑制Skp2对p27kip1的泛素化降解作用,进一步证实p27kip1的蛋白表达与Skp2蛋白表达呈负相关。与此同时我们还发现K562细胞无法通过G1/S期检查点进入S期,细胞大量凋亡,增殖明显抑制。