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左旋氧氟沙星(S-f(-)-Ofloxacin)，是第三代氟喹诺酮类药物氧氟沙星(Ofloxacin，OFL)的左旋光学异构体，具有生物利用度高、抗菌能力强、价格便宜等特点被广泛使用。但是，目前药品市场上左旋氧氟沙星的滥用和不合理使用问题十分突出。近年来，基于重组抗体的药物免疫分析方法(Immunoassay，IA)在药物安全性评价筛选方面有潜在的应用前景，对映体水平的基因工程抗体研究鲜见。针对以上问题，本研究主要进行了如下几个方面的工作： (1)抗S-OFL的噬菌体Fab与单链抗体构建、筛选及其鉴定 采用Trizol法从杂交瘤细胞系Z2C中提取总RNA，以设计的通用引物进行RT-PCR，分别扩增抗体κ链和Fd段基因，大小分别为642 bp和660 bp。将κ链和Fd段基因与载体p3MH连接并进行双酶切鉴定；之后，转化大肠杆菌XL1-Blue。对转化菌进行辅助噬菌体(helper phage)超感染后，以S-OFL-OVA为包被抗原对阳性重组子噬菌体抗体进行筛选，利用抗M13抗体对噬菌体抗体克隆进行phage-ELISA鉴定，证明了正确插入外源基因片段Fab的克隆具有S-OFL抗原结合活性，获得抗S-OFL Fab噬菌体抗体。 通过阳性Fab克隆质粒扩增轻重链可变区基因(VL、VH)，经重叠延伸PCR(Splicing by Overlap Extension PCR，SOE-PCR)合成scFv单链抗体基因片段。得到VL、VH基因片段大小分别约为324 bp和360 bp，而scFv基因全长为729 bp。将scFv基因与载体p3MH连接，经双酶切鉴定后，转化大肠杆菌XL1-Blue，对转化菌进行辅助噬菌体超感染；之后，以S-OFL-OVA为包被抗原筛选阳性重组子噬菌体抗体，采用抗M13抗体对噬菌体抗体克隆进行phage-ELISA鉴定，结果显示正确插入外源scFv基因片段的克隆具有S-OFL抗原结合活性，获得抗S-OFL scFv噬菌体抗体。 (2)抗S-OFL的Fab、scFv可溶性表达及性质研究 将重组质粒p3MH-Fab、p3MH-scFv敲除噬菌体外壳蛋白基因geneⅢ并自环化后，重新转化大肠杆菌XL1-Blue，IPTG诱导抗S-OFL，的Fab、scFv抗体可溶性表达，收集阳性上清浓缩纯化。经变性SDS-PAGE测定，Fab在分子量约为24 kDa处有一明显增粗条带，是Fab打开二硫键后的κ链与Fd段；scFv在分子量约为26 kDa处有一明显增粗条带；Western-Blot检测发现两者均能与抗His标签抗体特异性结合，说明抗左旋氧氟沙星的Fab、scFv抗体能够在大肠杆菌XL1-Blue中正确地进行可溶性表达。 间接ELISA结果显示，抗S-OFL的Fab和scFv在培养上清中均有表达。抗S-OFL的可溶性Fab、scFv抗体与抗原的结合可被游离的S-OFL竞争性抑制，IC50分别为40.8 ng/mL、80.8 ng/mL，具有很好的抗原结合活性。通过标准曲线可知线性检测范围分别在1.7～353.0 ng/mL与3.2～541.9 ng/mL之间，最低检测限分别为0.3 ng/mL、0.6 ng/mL。两种工程抗体对R-(+)-Ofloxacin的结合能力最强，其交叉反应率达到558.9％、442.3％，对Ofloxacin交叉率为227.0％、230.3％；且与FQs系列结构类似物只存在个别交叉反应。说明该抗体具有较好的灵敏度及特异性。 (3)抗S-OFL的Fab、scFv生物信息学初步研究 对抗S-OFL的κ链、Fd段、单链抗体的基因克隆进行测序，并根据测序结果推导其氨基酸序列。根据Kabat法则分别对VL、VH的FR(Frame Regions，框架区)区及CDR(Complementarity Determining Regions，互补决定区)区进行划分。NCBI数据库分析显示，抗S-OFL轻链基因序列推导的氨基酸序列与一鼠源性抗人赛米诺蛋白单克隆抗体的轻链基因(序列号：AAN85722)高度同源(90.99％)。抗S-OFL重链基因序列推导的氨基酸序列与一鼠源性抗TAT-HIV病毒Fab的重链基因(序列号：306K H)高度同源(79.2％)。对抗S-OFL基因工程抗体的部分理化性质进行了预测，结果表明根据ExPASy Proteomics tools分析，抗S-OFL Fab具有438个氨基酸，分子式为C2098H3226N560O680S16，分子量为47687.0 Da，等电点为6.67；抗S-OFL scFv具有243个氨基酸，分子式为C1140H1737N313O371S8，分子量为26019.6 Da，等电点为7.86。二级结构预测表明，抗S-OFL Fab含α螺旋58处，占13.36％；β折叠139处，占31.78％；β转角45处，占10.26％；无规则卷曲195处，占44.61％；抗S-OFL scFv含α螺旋14处，占5.76％；β折叠95处，占39.9％；β转角24处，占9.88％；无规则卷曲110处，占45.27％。根据同源建模法对抗S-OFL Fab、单链抗体进行了三维结构模拟，结果表明这两个基因工程抗体的三维模拟图符合典型的抗体结构，可观察到抗体可变区的6个环区(CDR区)及形成的抗原结合位点。