甜樱桃内参基因的筛选

来源 :河南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:selena2009
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甜樱桃是果实成熟期最早的树种之一,树形美观,果实营养丰富,管理用工少,生产成本低,经济效益极高,所以有着广阔的发展前景。近年来,有关甜樱桃的研究越来越多地采用分子生物学研究方法,而在进行基因表达分析研究时,需要内参基因对目标基因的表达量进行校准,以获得更加准确的结果。本研究以已发表的拟南芥的27个内参基因做为候选,利用qRT-PCR方法分别对其在甜樱桃品种艳阳不同生长时期的枝条、叶片和果实中的表达量,以及对内参基因在干旱、盐害、涝害、高温等逆境条件下植株叶片中的表达量进行分析,利用GeNorm,BestKeeper和NormFinder软件分析候选内参基因的表达稳定性,以期为甜樱桃的基因表达调控相关研究提供合适的内参基因。具体研究结果如下:1、从模式植物中共选取了27对候选内参基因,通过PCR检测共从中筛选出TEF2、RPII、18S、GAPDH、ACT、α-TUB、EFl-α-3、SAND-2、TUB、CYP2、RPL13共11个基因的引物能在甜樱桃基因组中扩增到目的条带,满足内参基因筛选的首要条件。2、对提取RNA的常规CTAB法进行缩短水浴的时间、延长离心和沉淀的时间、增加抽提次数等措施进行优化,得到了完整性好,无降解,纯度高的甜樱桃各样品RNA,28S和18S条带分离清楚,条带整齐无降解,能满足实验的要求。3、在甜樱桃营养器官中,geNorm、NormFinder和BestKeeper三个软件的分析结果一致。geNorm的分析结果显示内参基因表达的稳定性排列顺序为SAND-2=RPL13> α-TUB> CYP2> ACT> EF1-α-3> TEF2> RPII> TUB>18S> GAPDH,NormFinder的分析结果为:RPL13> CYP2=EF1-α-3> ACT> TEF2> α-TUB> SAND-2> RPII> TUB>18S>GAPDH。BestKeeper显示最稳定内参基因的是18S和CYP2。结合三个软件的分析,在甜樱桃的营养器官中,最适宜作为内参的基因是CYP2。4、在甜樱桃生殖器官中,geNorm、NormFinder和BestKeeper三个软件的结果不尽相同,geNorm分析显示内参基因的稳定顺序为TEF2=CYP2>18S> SAND-2> ACT>EFI-α-3> α-TUB> RPL13> TUB> RPII> GAPDH,NormFinder分析的结果为ACT> TUB> SAND-2> α-TUB> CYP2> EF1-α-3>18S> TEF2> RPII> RPL13> GAPDH。BestKeeper显示较为稳定的是18S和α-TUB。综合比较分析,推荐SAND-2、CYP2和α-TUB作为内参使用。5、在甜樱桃逆境处理中,geNorm和NormFinder的分析结果基本一致,BestKeeper的结果有所不同,geNorm分析显示内参基因的稳定顺序为:EF1-α-3=RPII> CYP2> TEF2>18S> RPL13> ACT> TUB> GAPDH> SAND-2> α-TUB。NormFinder的分析结果为18S>EF1-α-3> CYP2> RPII> RPL13> TEF2> ACT> TUB> GAPDH> SAND-2> α-TUB。BestKeeper软件分析结果显示,所有基因中表现较为稳定的是18S和GAPDH。综合考虑EF1-α-3、CYP2和RPII为比较稳定的内参基因,推荐使用。6、在甜樱桃的所有样品中,geNorm和NormFinder软件的分析结果一致,geNorm显示在所有的样品中,表达的稳定性排序为:TEF2=CYP2> EF1-α-3> RPII>18S> SAND-2>ACT> α-TUB> RPL13> TUB> GAPDH。NormFinder的分析结果为CYP2> EF1-α-3>18S> ACT> SAND-2> RPII> TEF2> RPL13> TUB> α-TUB> GAPDH,而BestKeeper的结果显示只有18S是可用的,综合分析后在所有的样品中推荐CYP2作为稳定的内参使用。
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