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由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）引起的猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS）是一种广泛存在于我国猪场并严重影响我国生猪养殖业健康发展的病原体。Mhp因其特殊的细胞结构而没有特效治疗药物,对常规的药物又极易产生耐药性,猪场一旦发生MPS就很难控制,因此做好免疫防控成了减少MPS损失的唯一有效途径。Mhp的培养条件苛刻,且培养物滴度较低,这直接影响了Mhp常规疫苗的研制与应用。所以,开发出一种成本低廉,效果确实的Mhp疫苗成了养猪业迫切的需求。本研究运用重组腺病毒载体表达技术,将Mhp的主要抗原基因粘附因子P97全基因重组到腺病毒穿梭载体,用脂质体介导的转染方法将重组穿梭载体pacAd5 Shuttle-P97与骨架质粒转入包装细胞AD293中,构建出了重组腺病毒Ad-P97,并对其免疫效果进行了检测与评价,得到了以下试验结果:（1）利用KM2培养基培养Mhp,离心收集菌体并提取其基因组DNA。以基因组DNA为模板,采用分段PCR的方式分别扩增了P97的前后两段基因,再利用酶切、连接以及连接产物直接PCR的方法获得了在5’端和3’端添加了限制性内切酶XhoⅠ以及BanⅢ酶切位点的P97全基因。经琼脂糖凝胶电泳验证,证实了目的基因P97的大小约为3.4Kb。（2）应用限制性内切酶XhoⅠ以及BanⅢ双酶切的方法对目的基因P97和腺病毒载体穿梭质粒进行双酶切,回收双酶切产物后应用T4连接酶将目的基因P97定向连接到穿梭载体,连接产物转化大肠杆菌DH5α,获得重组穿梭载体pacAd5Shuttle-P97。对重组穿梭载体进行单、双酶切验证,PCR验证后送至公司测序。测序结果仔细判读后证实P97插入穿梭载体的位点正确,P97全基因序列完整,证明重组穿梭载体pacAd5 Shuttle-P97构建成功。研究P97全基因序列还发现其中有三处编码色氨酸的密码子“TGA”需要定点突变成通用密码子“TGG”后才能在真核细胞中表达。（3）运用合成突变引物覆盖待突变位点进行PCR的方法得到四段突变产物,再利用重叠延伸PCR原理连接各个突变产物,完成P97全基因中三个位点的定点突变。将突变后的P97全基因重新克隆到穿梭载体,经测序验证后证实定点突变成功。（4）用脂质体介导的转染方法将线性化的腺病毒载体骨架质粒以及重组穿梭质粒导入AD293细胞,包装出一株含有目的基因P97的重组腺病毒Ad-P97。并运用RT-PCR、Western-blot、免疫荧光三种方法检测Ad-P97在宿主细胞内对目的基因的翻译与表达,证实了重组腺病毒Ad-P97的正确性。（5）大量扩增重组腺病毒Ad-P97,测定其病毒滴度为3.16×1011TCID50/mL,达到了试验的预期要求。（6）小鼠免疫试验结果表明,重组腺病毒疫苗Ad-P97以肌肉注射和滴鼻的方法免疫均能够诱导小鼠机体产针对Mhp的特异性抗体,且抗体滴度极显著的高于Ad-GFP腺病毒对照组（P<0.01）。仔猪免疫试验证明,重组腺病毒Ad-P97能够刺激仔猪机体产生针对Mhp的特异性抗体。综上,本研究成功的构建出了一株高滴度、且能有效刺激机体产生针对Mhp的特异性抗体的重组腺病毒疫苗。