西兰花CYP83B1基因的克隆及功能鉴定

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芥子油苷是十字花目植物中由氨基酸衍生来的特殊的代谢产物。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,起源于色氨酸的吲哚族芥子油苷是植物防御多种病原菌和食草动物所必需的,研究表明这些化合物具有很强的抗菌活性和潜在的信号功能。拟南芥作为模式植物,其芥子油苷的生物合成和降解已经研究得非常清晰了。西兰花(Brassica oleracea var.italica)是十字花科的常见蔬菜,不仅含有全面的营养成分和矿物质,还含有大量的芥子油苷,但关于其芥子油苷的代谢途径基因的研究却很少。因此对于西兰花中芥子油苷的相关研究具有重要意义。CYP83B1是拟南芥吲哚族芥子油苷生物代谢途径中的重要合成酶,可催化中间产物吲哚-3-乙醛肟(IAOx)生成1-酸式硝基-2-吲哚基-乙烷(1-aci-nitro-2-indolyl-ethane),并进一步合成吲哚族芥子油苷。IAOx不仅是吲哚族芥子油苷合成的中间产物,同时也是合成植物激素生长素的前体。CYP83B1的敲除可导致IAOx的累积,并产生明显的生长素过量如顶端优势的表型。因此CYP83B1不仅能参与吲哚族芥子油苷的生物合成还会影响植物的生长发育。本研究中,我们以前期西兰花转录组测序获得的数据为参考,从西兰花中克隆获得了CYP83B1的同源基因,将其命名为BoCYP83B1。通过将其在拟南芥中过量表达初步验证了该基因的功能,利用报告基因β-glucuronidase基因(GUS)和实时定量RT-PCR的方法对其空间表达模式及对多种不同激素和逆境胁迫的响应模式进行了系统分析,为深入探讨BoCYP83B1在芥子油苷代谢中的作用及在逆境胁迫反应中的功能奠定了基础。本论文主要研究结果如下:1.克隆BoCYP83B1通过RT-PCR方法克隆出西兰花中的CYP83B1,将其命名为BoCYP83B1,获得序列登录号KU559565。2.获得35S::BoCYP83B1转基因拟南芥构建35S::BoCYP83B1植物表达载体将其转入拟南芥中使BoCYP83B1过量表达。过量表达BoCYP83B1导致芥子油苷的含量发生变化,其中吲哚族芥子油苷的含量不变、脂肪族芥子油苷含量有所提高。同时35S::BoCYP83B1转基因拟南芥会产生早花的表型。3.BoCYP83B1空间表达模式分析构建PBoCYP83B1::GUS植物表达载体,通过BoCYP83B1启动子驱动GUS报告基因在拟南芥中的表达分析了BoCYP83B1的空间表达模式。结果表明在幼苗中子叶、真叶、根、下胚轴的维管组织中都有BoCYP83B1的表达。在成熟植株中,主要在叶柄、花梗、叶脉、萼片、雄蕊花丝、雌蕊柱头和未成熟的角果中表达。4.BoCYP83B1对多种激素及逆境胁迫的应答利用报告基因和实时定量RT-PCR的方法分析了BoCYP83B1在受到外源激素处理或外界胁迫条件下的空间表达模式。BoCYP83B1在茉莉酸甲酯、1-氨基-1-环丙烷甲酸(乙烯前体)、水杨酸(SA)、赤霉素和生长素处理后受到强烈的诱导,表达量显著增强,在经过甘露醇、NaCl、UV(紫外线)和Flagelin 22等逆境胁迫处理后,BoCYP83B1的表达量也显著提高,高温、低温和组织伤害也会影响BoCYP83B1的表达。此外,BoCYP83B1对于SA和NaCl的响应还存在组织特异性。
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