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熊胆粉是传统名贵稀缺药材,主要通过人工引流亚洲黑熊胆汁获得,而随着蛋白质工程和生物技术的发展,体外培育熊胆粉成为可能。课题组前期构建了7α-HSDH和7β-HSDH双酶偶联转化禽胆粉中牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）生成牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）体外培育熊胆粉的技术。鸡胆粉中TCDCA的含量高达42.58%,非胆汁酸成分与天然熊胆粉类似,是生物催化培育熊胆粉的最佳天然底物。然而鸡胆粉中含有4.743%的牛磺胆酸（TCA）,同时由于目前已报道的7α-HSDHs对TCDCA、TCA均有活性,从而导致反应产物中引入了新的具有致大肠癌风险的杂质牛磺脱氧胆酸（TUCA）,增加了后期产品分离纯化的困难,影响产品的品质。因此,筛选或构建具有底物选择性,且酶学品质优良的催化关键酶——7α-HSDHs是能否高效大规模体外培育熊胆粉的关键。因此,本研究基于蛋白序列信息、二级结构和三维建模分析,应用基因工程技术对课题组前期获得的新的7α-HSDH（St-2-2）进行了半理性改造研究,获得了多个催化活性、热稳定性显著提高、底物选择性发生改变的突变体,探讨分析了关键氨基酸位点的作用以及结构和功能之间的关系。进一步进行联合突变获得了对TCDCA保持较高活性,而对TCA不具有活性的突变体I255G△C6,将其应用于催化转化鸡胆粉制备熊胆粉中,并对转化条件进行了研究。本研究首次获得了对TCDCA和TCA具有底物选择性的7α-HSDH突变体,为羟基类固醇脱氢酶底物选择性改造提供了可行策略,为催化转化鸡胆粉制备熊胆粉提供了具有底物选择性的催化剂,奠定了体外培育熊胆粉的工业化基础。主要研究内容和结果如下:（1）基于蛋白序列-结构-功能之间的关系,对St-2-2羧基端进行了半理性改造,获得6个催化活性提高2倍的突变体及底物选择性突变体St-2-2△C10。1)催化活性研究表明,突变体I255F、I255Q、I255A、I255N、I255S和I255G对TCDCA的活性分别提高了109.5%、116.1%、137.2%、233.1%、236.4%、285.9%;而对TCA的活性分别降低至野生型的4.9%、15.5%、5.8%、7.3%、7.2%、4.6%,实现了催化活性的反转。2)采用尾部截短策略进一步探究羧基端对酶催化活性的影响,结果发现突变体St-2-2△C10对TCA、甘氨胆酸（GCA）的活性完全丧失,而对TCDCA的催化活性仍保留14.9 U/mg,出现了底物选择性。3)选取I255A、I255G、St-2-2△C10进行热稳定性研究,结果表明I255A、I255G的Tm值较野生型分别提高了3.2oC、4.1oC,而St-2-2△C10的Tm值较野生型降低了4.0oC;310 K下MD分析也发现I255A、I255G的RMSD较野生型更为稳定,而St-2-2△C10的RMSD较野生型明显升高。4)三维结构分析结果表明,羧基端氨基酸残基参与亚基内及亚基间的相互作用,I255A、I255G的255位均与Ser253形成新的氢键增加了其热稳定性,而St-2-2△C10随着尾部截短,相互作用的氢键数目减少从而导致稳定性降低。以上研究结果表明羧基端氨基酸残基之间的相互作用在维持St-2-2的催化功能和热稳定性中具有重要作用,且对羧基端进行改造是实现底物选择性的可行策略。（2）基于分子对接技术,锁定氨基端辅酶结合位点进行半理性改造,获得多个活性提高的突变体。1)催化活性研究表明,T15A对TCDCA的催化活性提高了685.4%（p＜0.001）;T15L、T15Q、T15R、T15G、R16S、R16G、R16A、R16Q对TCDCA的催化活性分别提高了131.2%、173.6%、180.6%、217.8%、106.4%、106.8%、150.2%、335.4%;相反对TCA的催化活性降低至野生型的16.4%、40.3%、41.6%、48.8%、22.0%、8.0%、39.9%、28.9%。2)选取催化活性大幅提高的T15A、R16A、R16Q进行热稳定性研究,结果表明其Tm值分别提高了4.2oC、6.0oC、7.0oC;310K下MD分析也发现突变体RMSD较野生型更为稳定。3)通过圆二色光谱法进行二级结构测定,结果表明T15A、R16A、R16Q的α-螺旋含量减少,β-折叠含量增加,以维持蛋白结构的稳定性;氨基酸亲疏水性分析结果表明位于分子内部的氨基酸（Thr15、Arg16）突变成疏水性更强的氨基酸（Ala、Gln）能够提高其热稳定性。4)同源建模及三维结构分析的结果表明T15A中Arg38、R16Q中Asp194增加了与辅酶的锚定作用,进而加强了辅酶和酶之间连接的紧密性使得结合口袋中底物的构型更加稳定从而提高了酶的催化活性。以上结果表明通过改变氨基端辅酶结合位点氨基酸残基是提高HSDHs催化活性和热稳定性的可行策略。（3）基于多重策略以底物选择性为导向进行改造,获得了具有底物选择性的I255G△C6并将其应用于催化转化复杂底物制备熊胆粉中。1)I255G△C6对TCA不具有催化活性,对TCDCA的催化活性为40.3±6.1 U/mg,是St-2-2△C10的2.7倍。热稳定性研究表明,I255G△C6的Tm值为59.7oC,与St-2-2相比升高了3.1oC;310 K下MD分析发现I255G△C6的RMSD值在1.5-2.0（?）之间波动较野生型更为稳定;进一步结构分析表明保留关键位点I255G,新增了与Ser253位之间的作用力从而增加了其热稳定性。3)采用I255G△C6联合7β-HSDH催化转化鸡胆粉,并对其反应条件进行优化。结果表明最佳p H为9.5,最佳底物浓度为2 m M,最佳辅酶浓度为2 m M,最佳反应时间为5 h,最佳缓冲液浓度为50 m M Gly-Na OH。经HPLC-ELSD分析,I255G△C6不催化TCA转化生成TUCA。由此可见,以具有底物选择性的I255G△C6为催化剂,催化转化鸡胆粉既避免了新杂质的引入,也保留了非胆汁酸成分,为原位生物转化体外培育熊胆粉奠定了基础。