论文部分内容阅读
目的：通过观察利妥昔单抗(RTX)对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)大鼠发病情况、中枢神经系统病理改变、外周血中B细胞含量变化以及脑组织中白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-17(IL-17)、γ-干扰素(IFN-γ)含量变化和血清中髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘碱性蛋白抗体(Anti-MBP)含量变化的影响，探讨RTX对EAE的防治作用及其可能的免疫学机制，为RTX治疗多发性硬化(MS)寻找充分的理论依据。方法：1．分组、造模及给药：采用粗制髓鞘碱性蛋白(CMBP)加完全福氏佐剂(CFA)皮下注射的方法建立EAE模型，EAE模型分为RTX高、中、低剂量治疗组和EAE对照组，每组10只；正常对照组10只，按EAE模型组的方法注射生理盐水及CFA。自造模当日开始给药，RTX高、中、低剂量治疗组腹腔内注射RTX，剂量分别为100mg/kg/d、50mg/kg/d、25mg/kg/d，连续治疗3天，正常对照组及EAE组腹腔注射生理盐水2ml/d。于EAE对照组、RTX各治疗组连续3天症状评分无加重或四肢瘫痪、死亡时作为EAE发病高峰期处死发病大鼠，濒死大鼠在尚有心跳、体温时处死，其余观察8周结束时全部处死。2．观察大鼠发病情况、潜伏期、进展期和高峰期神经功能障碍评分及死亡率的变化。3．采用光镜观察各组大鼠脑及脊髓组织病理变化。4．采用流式细胞仪计数各组大鼠外周血B细胞数。5．采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测各组大鼠脑组织匀浆中IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ的含量。6．采用ELISA法检测各组大鼠血清中MBP和Anti-MBP的含量。7．将EAE对照组及RTX各治疗组指标进行相关性分析。8．所有数据采用SPSS17.0软件进行统计分析。结果：1．大鼠发病情况：(1)临床症状：正常对照组大鼠无异常表现；EAE对照组及RTX各治疗组所有大鼠均发病，潜伏期10-30天不等，发病大鼠先后出现进食减少、体重下降、萎糜、后肢无力、自伤后肢、后肢完全不能活动等表现，严重者四肢瘫痪、抽搐，甚至死亡，RTX各治疗组大鼠临床症状较EAE对照组明显减轻，其中高剂量治疗组减轻最明显。(2)潜伏期变化：RTX各治疗组的潜伏期较EAE对照组延长(P<0.01)；RTX高、中剂量治疗组的潜伏期较RTX低剂量组延长(P<0.01)，RTX高剂量治疗组潜伏期较RTX中剂量治疗组延长(P<0.01)。(3)进展期变化：RTX各治疗组大鼠发病的进展期与EAE对照组相比明显缩短(P<0.01、P<0.05)；RTX高、中剂量治疗组进展期较RTX低剂量组缩短(P<0.01、P<0.05)，RTX高剂量治疗组进展期较RTX中剂量治疗组缩短(P<0.01)。(4)发病高峰期神经功能障碍评分变化：RTX各治疗组大鼠发病高峰期神经功能障碍评分较EAE对照组明显降低(P<0.01、P<0.05)；RTX高、中剂量治疗组发病高峰期神经功能障碍评分较RTX低剂量治疗组降低(P<0.01、P<0.05)，RTX高剂量治疗组发病高峰期神经功能障碍评分较RTX中剂量治疗组降低(P<0.05)。(5)死亡率：RTX高剂量治疗组死亡率比EAE对照组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；RTX低、中剂量治疗组死亡率比EAE对照组低，但差异无统计学意义(P>0.05)，而RTX高、中、低剂量治疗组之间死亡率比较无统计学差别(P>0.05)。2.脑及脊髓病理变化：正常对照组大鼠脑及脊髓无病理改变；EAE对照组及RTX各治疗组大鼠的脑和脊髓都出现了EAE典型的病理改变，小血管周围炎性细胞浸润呈“袖套”状的改变，血管周围白质明显的脱髓鞘改变；RTX各治疗组脱髓鞘改变及炎性细胞浸润较EAE对照组减轻；RTX高、中剂量治疗组较RTX低剂量治疗组减轻，RTX高剂量治疗组病理改变最轻。各组大鼠脑及脊髓HE染色后，对脑组织中的炎性细胞浸润情况进行评分：EAE对照组和RTX各治疗组大鼠脑组织中的炎性细胞浸润评分均较正常对照组明显增加(P均<0.01)；RTX各治疗组炎性细胞浸润评分较EAE对照组降低(P均<0.01)；RTX高、中剂量治疗组脑组织炎性细胞浸润评分较RTX低剂量治疗组低(P<0.01、P<0.05)，RTX高剂量治疗组脑组织炎性细胞浸润评分较RTX中剂量治疗组低(P<0.05)。3.各组大鼠外周血B细胞数变化：EAE对照组和RTX低、中剂量治疗组大鼠外周血B细胞数较正常对照组明显升高(P<0.01、P<0.05)；RTX高剂量治疗组大鼠外周血B细胞数较正常对照组明显降低(P<0.01)；RTX各治疗组大鼠外周血B细胞数低于EAE对照组(P<0.01、P<0.05)；RTX高、中剂量治疗组大鼠外周血B细胞数较RTX低剂量治疗组低(P均<0.01)，RTX高剂量治疗组大鼠外周血B细胞数较RTX中剂量治疗组低(P<0.01)。4.脑组织匀浆中IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ的含量变化：EAE对照组、RTX各治疗组大鼠脑组织匀浆中IL-4、IL-10含量均较正常对照组明显降低(P均<0.01)，RTX各治疗组脑组织匀浆中IL-4、IL-10的含量显著高于EAE对照组(P均<0.01)；RTX高、中剂量治疗组脑组织匀浆中IL-4、IL-10含量明显高于RTX低剂量治疗组(P均<0.01)；RTX高剂量治疗组脑组织匀浆中IL-4、IL-10的含量高于RTX中剂量治疗组(P<0.01、P<0.05)；EAE对照组、RTX各治疗组大鼠脑组织匀浆中IL-17、IFN-γ的含量均较正常对照组明显升高(P均<0.01)；RTX各治疗组脑组织匀浆中IL-17、IFN-γ的含量显著低于EAE对照组(P<0.01、P<0.05)；RTX高、中剂量治疗组脑组织匀浆中IL-17、IFN-γ的含量低于RTX低剂量治疗组(P均<0.01)；RTX高剂量治疗组脑组织匀浆中IL-17、IFN-γ的含量低于RTX中剂量治疗组(P<0.01、P<0.05)。5.各组大鼠血清中MBP和Anti-MBP的含量变化：EAE对照组、RTX治疗组大鼠血清中MBP和Anti-MBP的含量均较正常对照组明显升高(P均<0.01)；RTX各治疗组血清中MBP和Anti-MBP的含量显著低于EAE对照组(P均<0.01)；RTX高、中剂量治疗组血清中MBP和Anti-MBP的含量低于RTX低剂量治疗组(P均<0.01)；RTX高剂量治疗组血清中MBP和Anti-MBP的含量低于RTX中剂量治疗组(P均<0.01)。6．相关性分析：①EAE对照组及RTX各治疗组大鼠外周血B细胞数、脑组织匀浆中IL-17、IFN-γ的含量和血清中MBP和Anti-MBP的含量与潜伏期呈明显负相关(P均<0.01)；EAE对照组及RTX各治疗组大鼠脑组织匀浆中IL-4、IL-10的含量与潜伏期呈明显正相关(P均<0.01)。②EAE对照组及RTX各治疗组大鼠外周血B细胞数、脑组织匀浆中IL-17、IFN-γ的含量和血清中MBP和Anti-MBP的含量与进展期呈明显正相关(P<0.01、P<0.05)；EAE对照组及RTX各治疗组大鼠脑组织匀浆中IL-4、IL-10的含量与进展期呈明显负相关(P均<0.01)。③EAE对照组及RTX各治疗组大鼠外周血B细胞数、脑组织匀浆中IL-17、IFN-γ的含量和血清中MBP和Anti-MBP的含量与高峰期神经功能障碍评分呈明显正相关(P<0.05、P<0.01)；EAE对照组及RTX各治疗组大鼠脑组织匀浆中IL-4、IL-10的含量与高峰期神经功能障碍评分呈明显负相关(P均<0.01)。④EAE对照组及RTX各治疗组大鼠外周血B细胞数、脑组织匀浆中IL-17、IFN-γ的含量和血清中MBP和Anti-MBP的含量与炎性细胞浸润程度评分呈明显正相关(P<0.01、P<0.05)；EAE对照组及RTX各治疗组大鼠脑组织匀浆中IL-4、IL-10的含量与炎性细胞浸润程度评分评分呈明显负相关(P均<0.01)。结论：1．采用多点皮下注射WSCH+CFA诱导Wistar大鼠，建立EAE模型，EAE大鼠临床症状明显，脑组织病理改变典型，说明EAE模型成功，模型稳定、可靠。2．B细胞和MBP、Anti-MBP有促进EAE发生的作用；其作用机制可能是：B细胞通过提呈抗原和产生抗体即提呈MBP和产生Anti-MBP而促进EAE的发生。3．IL-4、IL-10能抑制EAE的发生、发展；而IL-17、IFN-γ则对EAE发病起促进作用。4．RTX能延长EAE大鼠发病潜伏期、缩短发病进展期、减轻EAE大鼠神经功能障碍、降低EAE动物的死亡率、减轻EAE大鼠脑组织病理损害，对EAE发病具有防治作用。5．RTX可能主要是通过降低EAE大鼠外周血B细胞数，使外周血B细胞数耗竭，B细胞抗原提呈和产生抗体的作用减弱，从而起到防治EAE的作用。6．RTX可通过促进细胞因子IL-4和IL-10的分泌、抑制IL-17和IFN-γ的合成来起到防治EAE的作用。