猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是目前威胁全世界养猪业的主要肠道病原体之一。PEDV感染新生仔猪,会导致严重的腹泻、脱水和死亡。从2010年开始,PED（porcine epidemic diarrhea）在中国地区大规模爆发,造成了该产业的巨大损失。PEDV属于冠状病毒科α冠状病毒属,拥有约28 kb的单股正链RNA基因组,它的基因组编码病毒复制酶多聚蛋白（pp）la和1ab,棘突（S）,附属蛋白（ORF3）,包膜（E）,膜（M）和核衣壳（N）蛋白。orf3位于PEDV基因组中s基因与e基因之间,编码224个氨基酸约为25 k D的蛋白质。但在细胞适应的PEDV毒株中,ORF3往往会有49个核苷酸的缺失,携带该基因的毒株比较典型的是弱毒的DR13(本研究中命名为DR13^att)。关于由orf3基因编码的ORF3蛋白,它的功能研究还比较薄弱。有文献报道PEDV可以引起感染细胞凋亡。在我们前期研究中,发现携带orf3的重组PEDV所致细胞坏死状态要轻于不携带该基因的重组PEDV。因此我们推测ORF3蛋白对于PEDV感染后的细胞凋亡有影响。为此,本研究利用携带三种不同orf3基因的PEDV感染细胞,用多种方法,如活细胞成像,流式细胞术,TUNEL,转录组分析等来研究ORF3与该病毒诱导的细胞凋亡的关系。本研究的研究内容及结果如下:（1）3种PEDV重组病毒感染后的细胞病变。三种不同的PEDV病毒r DR13^att-?ORF3,DR13^att和r DR13^att-ORF3^wt以MOI=0.5感染Vero细胞,感染24 h后显微镜下观察细胞病变并采集图像,可以观察到r DR13^att-?ORF3引起较多的细胞病变。（2）三种病毒的S蛋白和ORF3蛋白的免疫荧光检测。PEDV病毒r DR13^att-?ORF3,DR13^att和r DR13^att-ORF3^wt以MOI为1和0.5感染Vero细胞,培养24 h后进行免疫荧光分析检测PEDV S蛋白和ORF3蛋白的表达。结果显示,感染后24小时PEDV S蛋白能在被感染的细胞内表达,并且除r DR13^att-?ORF3感染组外,ORF3蛋白也能在被感染的细胞内表达,该结果证实三种病毒能够成功感染Vero细胞,携带orf3的病毒可以正常表达ORF3蛋白。（3）ORF3蛋白在病毒诱导的细胞凋亡中所起的作用方法一:细胞成像仪检测细胞凋亡。三种PEDV(r DR13^att-ORF3^wt,DR13^att和r DR13^att-?ORF3)以MOI为0.1感染Vero细胞,在感染后不同时间点进行活细胞染色后对细胞凋亡程度（早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞）进行数据分析。结果显示,三种不同病毒侵染的细胞凋亡水平随着时间的延长均高于正常阴性细胞,但敲除orf3的病毒感染细胞后细胞凋亡率比其它两种病毒更高。方法二:流式细胞仪检测细胞凋亡。病毒r DR13^att-?ORF3,DR13^att和PEDV r DR13^att-ORF3^wt以MOI=5感染Vero细胞,分别在18 h,24 h终止感染,根据凋亡试剂盒说明书的步骤处理细胞后,在流式细胞仪上进行检测。检测结果进一步验证了细胞成像的结果,敲除orf3病毒感染细胞凋亡率显著高于其他两种病毒。方法三:TUNEL法检测细胞凋亡。TUNEL法是细胞凋亡检测的经典实验方法之一。病毒r DR13^att-?ORF3,DR13^att和PEDV r DR13^att-ORF3^wt以MOI=3感染Vero细胞,染色结果进一步表明,r DR13^att-?ORF3病毒感染细胞后TUNEL阳性细胞数比DR13^att和r DR13-ORF3^wt更多。方法四:Westernblot法检测Caspase-3的活化。病毒r DR13^att-?ORF3,DR13^att和PEDV r DR13^att-ORF3^wt以MOI=0.1感染Vero细胞,感染48 h终止;处理细胞制成蛋白样品,进行SDS-PAGE及Western blot。Western blot结果说明表达ORF3蛋白的重组PEDV可以抑制Caspase-3的活化。（4）转录组测序及荧光定量PCR法检测ORF3作用通路的相关基因表达。病毒r DR13^att-?ORF3和PEDV r DR13^att-ORF3^wt以MOI=5感染Vero细胞,感染12 h终止;把终止感染后的样本按Eastep?Super总RNA提取试剂盒说明进行处理,提取RNA,将总RNA送至广州基迪奥生物科技有限公司进行转录组测序。转录组测序结果表明不同病毒感染细胞的基因表达有差异,推测ORF3蛋白对受感染细胞Heat shock 70 k Da protein 1B（HSP70）基因转录有促进作用。用荧光定量PCR验证转录组结果,荧光定量PCR中r DR13^att-ORF3^wt感染细胞的HSP70表达量高于r DR13^att-?ORF3感染细胞,与转录组结果相符。以上实验结果表明ORF3蛋白可以抑制PEDV诱导的细胞凋亡,而且这种作用可能是通过抑制Caspase-3的活化或增加HSP70的产生来完成的。本研究结果为进一步探讨ORF3蛋白在猪流行性腹泻病毒的感染机制方面奠定基础。