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天蚕素(Cecropins)是昆虫抗菌肽(antibacterialpeptide)的一类，由31～39个氨基酸残基组成的短链多肽，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有很强的抑制作用，对病毒、肿瘤细胞、原虫、真菌也有一定的抑制作用。本研究选择家蝇三龄幼虫为实验材料，用分子生物学手段，对其血淋巴免疫动力学，cecropin基因的克隆、改造、体外高效表达、杀菌活力和抗菌谱等进行了初步的研究，为家蝇抗菌肽的开发提供了依据。
本研究利用E.coliK12D31、针刺加E.coliK12D31、紫外照射、生理盐水四种诱导源，对家蝇三龄幼虫进行诱导，比浊法测定了血淋巴的杀菌活性。结果表明，四种诱导源都能诱导家蝇三龄幼虫产生抗菌活性物质，活性高峰分别出现在诱导后48h、48h、60h和36h，针刺加大肠杆菌诱导活性高峰要强于其它三种诱导源。SDS-PAGE检测表明，四种诱导源都能增强家蝇幼虫血淋巴原有抗菌蛋白的表达量，并能激活大约4.0kDa新的蛋白产生。半定量RT-PCR检测表明，家蝇幼虫体内抗菌肽cecropin、defensin和attacin是诱导型表达。在外界物质刺激下，表达量迅速升高，12h达到高峰，并持续较长时间。广谱抗菌实验表明，家蝇血淋巴对水产上的一些病原菌如嗜水气单胞菌(Aerononashydrophila)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)、美人鱼弧菌(Vibriodamsela)和温和气单胞菌(Aeromonassobria)等具有很高的抑制作用，为家蝇幼虫在水产养殖上的应用奠定了基础。
本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆了家蝇三龄幼虫体内cecropin基因。家蝇cecropin基因全长为371bp，序列分析表明，cecropin基因的ORF为192bp，编码63个氨基酸，分子量为6.7kDa，等电点为10.01。其中7-26位氨基酸为跨膜螺旋区域，1～22位氨基酸为信号肽序列，23-26位氨基酸为前导肽序列，27-63位氨基酸为成熟肽序列。在血淋巴中可剪切形成分子量为3.9kDa具有杀菌活性的成熟肽(Mdmcec)。运用半定量RT-PCR对家蝇cecropin基因的时空表达差异性进行检测。结果表明，cecropin基因在家蝇体内为诱导型表达，表达量随着诱导时间的增加而增加。家蝇cecropin基因主要表达部位为脂肪体，中肠也存在着微量的表达。
运用PCR方法突变了家蝇cecropin成熟肽C末端，使其更具酰胺化，克隆到毕赤酵母表达载体，构建分泌型表达载体pPICZαA-Mdmcec，用SacⅠ线性化载体，采用电激法转化毕赤酵母GS115，筛选了具有Zeocine抗性的阳性克隆，确定甲醇表型。对Mut+(甲醇营养快速型)和Muts(甲醇营养慢速型)两种菌株摇瓶培养，Tricince-SDS-PAGE电泳检测表明Muts菌株表达家蝇cecropin明显高于Mut+菌株。选取Muts菌株进行摇瓶培养条件优化，结果表明，当以OD600等于6.0酵母菌体为种子菌，诱导pH值为6.0，诱导甲醇浓度为1.0％，发酵后期追加营养液BMMY，摇瓶发酵时间达到120h时，发酵上清中的Mdmcec表达量最高，为19.8μg/mL。采用阳离子交换层析纯化了表达上清中的Mdmcec，高效液相色谱(HPLC)和Tricince-SDS-PAGE电泳分析表明阳离子交换层析可一步得到较纯的Mdmcec。用琼脂孔穴扩散法进行活性检测，结果表明家蝇cecropin对E.coliK12D31和staphylococcusaureus有明显的抑制作用，最小抑制浓度(MIC)分别为0.1μM和2.1μM。
为进一步提高Mdmcec纯化率，本研究利用6His-tag的特点，构建了C-末端带有6×His和c-myc-6His纯化标签的Mdmcec表达载体，并实现了在毕赤酵母中的高效分泌表达，采用镍金属螯合层析可一步纯化目的蛋白。活性分析表明，Mdmcec/6×His和Mdmcec具有相类似的活性，而Mdmcec/c-myc+6His不具有杀菌活性。
为确定Mdmcec结构与功能的关系，并进一步筛选到杀菌活力更强，抗菌谱更广的抗菌肽。本研究利用酵母偏爱的密码子，合成了Mdmcec的三个类似物CE(1～27)CE(1～10)、CE(K-L,R-A)和CE(1～11)CD(12～37)和两个杂合肽cecropin(1-8)-Magainin(1-12)和cecropin(1-13)-Mellitin(1-13)的cDNA片段。利用PCR的方法扩增得到Mdmcec类似物和杂合肽的cDNA全序列，构建了酵母表达载体，在酵母中得到了高效分泌表达，并筛选到具有抗菌活性的CE(1～11)CD(12～37)、CE(1～27)CE(1～10)及Ce(1-8)-Ma(1-12)。活性分析表明，CE(1～11)CD(12～37)对细菌和真菌的抑制活性要高于Mdmcec。CE(1～27)CE(1～10)对细菌的抑制作用要低于Mdmcec，而对真菌的抑制作用要大于Mdmcec。Ce(1-8)-Ma(1-12)比Mdmcec的抗菌谱更广，并且对耐药性菌株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)有较强的抑制作用。
为提高Mdmcec在酵母中的表达量和提高Mdmcec在酵母表达上清中的活性。本研究利用同源克隆的方法克隆了家蝇泛素(UBI)基因的ORF，经序列分析后，利用PCR方法突变了其C末端的碱基序列，使其带上SacⅡ的酶切位点，将UBI和α-factor信号肽融合，构建了能表达天然N末端蛋白的毕赤酵母表达载体。将Mdmcec及其类似物和杂合肽克隆到UBI下游，构建了酵母重组表达载体pPICZ-UBIMdmcec、pPICZα-UBICB、pPICZα-UBICAD和pPIC9-UBI-MA、pPIC9-UBI-CEMA，并在酵母中得到高效表达。Tricince-SDS-PAGE电泳和Westernblot检测表明UBI和抗菌肽在α-factor信号肽的引导下，可以被毕赤酵母正确分泌到胞外。活性检测表明，酵母本身分泌的泛素水解酶可以特异性的识别并切割泛素下游的抗菌肽。Tricince-SDS-PAGE分析表明UBI可以使Mdmcec、cecropinB、cecropinAD、magainin、Ce(1-8)-Ma(1-12)抗菌肽在酵母中的表达提高1.5倍。
总之，家蝇抗菌肽cecropin基因的克隆丰富了昆虫抗菌肽家族；对家蝇cecropin类似物和杂合肽的研究，为寻找抗菌活力更强、杀菌谱更广的抗菌肽提供了一种新的途径；家蝇cecropin在体外的高效表达和简单经济的纯化为抗菌肽大规模的应用奠定了良好的基础。