CC16蛋白质主要由位于终末细支气管的无纤毛柱状上皮细胞（Clara cell）分泌产生,其分子量接近16k D,所以称之为CC16。目前认为CC16是肺的内源性抗炎因子,具有重要的免疫炎症调节作用。慢性炎症性肺部疾病例如COPD,患者肺内Clara细胞及CC16明显降低,促进了疾病的发生发展。参与COPD发病的重要炎症介质包括MMP-9,IL-6,IL-8,TNF-α,而NF-κB信号通路在炎症反应中具有重要地位。外源性给予抗炎因子CC16,有可能抑制炎症介质的产生,从而对炎症性肺部疾病产生治疗干预作用。本研究首先利用基因工程技术,诱导表达重组的CC16蛋白质,纯化并鉴定具有生物学活性后,用于炎症干预研究。通过LPS刺激诱导体外培养的大鼠气道上皮细胞,产生一系列炎症介质,给予重组的CC16蛋白质进行干预后,观察各炎症因子的变化。进一步应用分子生物学技术,探讨重组CC16抑制炎症因子产生的分子机制。为重组CC16作为抗炎剂用于炎症性肺疾病,如COPD等疾病的治疗提供理论依据。第一部分大鼠Clara细胞分泌蛋白CC16基因的克隆和原核表达及纯化目的:克隆大鼠Clara细胞分泌蛋白（CC16）基因,原核表达并纯化重组的CC16蛋白,为进一步研究CC16蛋白的功能及对炎症性肺部疾病的治疗作用奠定基础。方法:制备大鼠肺组织总RNA,根据大鼠CC16基因全长编码序列（Gen Bank登录号:NM₀13051）的开放阅读框设计引物并进行逆转录PCR（RT-PCR）扩增,扩增产物经双酶切后连接入p ET30a（+）原核表达载体,重组质粒转化感受态细胞（E.coli DH5α）,阳性克隆经菌液PCR、双酶切及测序进行鉴定。将重组质粒p ET30a（+）-r CC16转化至E.coli Rosetta（DE3）并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结合考马斯亮蓝染色检测表达产物,重组融合蛋白经Ni2+琼脂糖凝胶亲和纯化。分别以抗His标签抗体和山羊抗CC16抗体进行免疫印迹（Western blotting）分析并鉴定重组蛋白。采用高效液相色谱法测定重组蛋白的纯度。结果:RT-PCR扩增产物约为290 bp。菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒p ET30a（+）-r CC16构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约16 k D的可溶性重组蛋白。免疫印迹（Western blotting）结果表明,诱导表达的蛋白质为带His标签的重组融合蛋白,而且能被山羊抗CC16抗体识别。经测定重组CC16蛋白质纯度为96.03%结论:成功构建基因重组体p ET30a（+）-r CC16,并制备出可溶性大鼠重组CC16蛋白质。第二部分重组CC16蛋白质通过NF-κB信号通路抑制脂多糖（LPS）诱导的气道上皮炎症介质的表达第一节重组CC16蛋白质对LPS诱导的IL-8、IL-6、TNF-:和MMP-9表达的影响目的:明确重组大鼠CC16（r CC16）对LPS诱导的炎症介质的干预作用。方法:（1）采用酸碱滴定法,通过测定磷脂酶A2（PLA2）的活性,验证重组的CC16蛋白质是否具有生物学活性。（2）体外培养大鼠气道上皮（RTE）细胞,以不同剂量r CC16（5、10和20μg/ml）与RTE共孵育1、3、5、7天,采用CCK-8试剂盒和台盼蓝染色法测定r CC16对RTE细胞增殖及活力的影响。（3）体外培养RTE细胞,加入LPS（0.1μg/ml）刺激细胞,并以不同剂量r CC16（0.5、1.0和2.0μg/ml）进行干预24h。采用ELISA法测定细胞上清中MMP-9、IL-6、IL-8和TNF-α的含量;采用反转录q PCR法测定各组细胞MMP-9、IL-6和TNF-αm RNA水平;采用明胶酶谱法测定MMP-9的活性。结果:（1）体外实验显示r CC16可抑制PLA2的活性,并呈剂量依赖性,在剂量为0.5μg/ml时即有抑制作用,随着剂量的增大（1.0和2.0μg/ml）,r CC16对PLA2的抑制作用更加明显。（2）r CC16在较大剂量时（10μg/ml和20μg/ml）对RTE细胞的增殖有抑制作用,但对RTE的细胞活性无影响。根据以上两部分实验结果,我们选择低剂量r CC16（小于5μg/ml）作为干预研究的剂量,该剂量下r CC16对细胞增殖及活性无影响,同时又具备了生物活性。（3）LPS刺激RTE细胞24h后,MMP-9、IL-6、IL-8和TNF-αm RNA及蛋白含量较对照组明显升高,MMP-9活性亦增高。给予不同剂量r CC16干预后,LPS诱导的上述炎症介质的表达被抑制。r CC16对MMP-9、IL-6和IL-8的抑制作用呈剂量依赖性,随着r CC16剂量增加抑制作用增强,而对TNF-α的抑制则表现为低剂量r CC16（0.5μg/ml）强于较高剂量组。结论:r CC16蛋白质具有抗炎活性,在不影响RTE细胞增殖及活性的剂量下,可抑制LPS诱导的MMP-9、IL-6、IL-8和TNF-αm RNA及蛋白的表达。第二节重组CC16蛋白质抑制LPS诱导的NF-κB的活化及其机制研究目的:探讨r CC16抑制LPS诱导的炎症因子表达的分子机制。方法:体外培养RTE细胞,加入LPS刺激细胞,并以不同剂量r CC16进行干预1h。以双荧光素酶报告基因系统检测各组NF-κB的转录活性。提取胞核蛋白,采用电泳迁移率（EMSA）实验检测NF-κB与靶基因的结合能力。分别提取胞浆、胞核蛋白,采用Western blotting法检测NF-κBp65的核浆含量,同时用免疫荧光染色显示NF--κBp65的胞内分布。应用Western blotting检测LPS刺激及r CC16干预后RTE细胞I-κBα、p-I-κBα、p-NF-κB、total NF-κB、p38和p-p38的变化。结果:（1）LPS刺激后NF-κB转录活性明显增高,较空白对照组高出约9倍。1μg/ml和2μg/ml的r CC16均可明显抑制LPS诱导的NF-κB的转录活性,并呈剂量依赖性,抑制率分别为38.8%和62.6%。（2）LPS可促进RTE细胞NF-κB与DNA的结合,而1μg/ml和2μg/ml的r CC16可明显抑制LPS诱导的NF-κB与DNA的结合。（3）LPS刺激RTE细胞后,细胞核内NF-κB含量明显增多,给予不同剂量r CC16干预后,细胞核内NF-κB含量较单纯LPS组明显降低,并具有剂量依赖性,随着r CC16剂量增加,细胞核内NF-κB含量更少。（4）LPS刺激RTE细胞后磷酸化的IκBα、NF-κBp65和p38明显增多。不同剂量r CC16干预后,它们的磷酸化水平较单纯LPS刺激组下降,并呈剂量依赖性,随r CC16剂量增加对IκBα、NF-κBp65和p38磷酸化的抑制作用增加。结论:r CC16可通过两条途径抑制LPS诱导的RTE细胞抑制NF-κB的活化:①抑制I-κB的磷酸化,从而抑制NF-κB的核定位;②抑制p38的磷酸化,进而抑制NF-κBp65的磷酸化。第三部分重组CC16蛋白质通过网格蛋白介导内吞入胞机制的初步探讨目的:初步探讨网格蛋白介导的内吞（CME）在r CC16进入RTE细胞及其发挥抗炎效应中的作用。方法:（1）体外培养RTE细胞,分为空白对照组、r CC16组和Chlorpromazine（CME抑制剂）+r CC16组。Chlorpromazine+r CC16组在加入Chlorpromazine（30μM）30 min后在加入r CC16（2μg/ml）,r CC16组直接在培养基中加入r CC16（2μg/ml）。采用免疫荧光染色法,一抗采用抗His标签抗体,观察各组细胞r CC16的分布情况。（2）体外培养RTE细胞,在培养体系中加入Chlorpromazine抑制网格蛋白介导的内吞作用后,以r CC16干预LPS刺激的细胞,采用Western blotting和免疫荧光染色法检测各组RTE细胞NF-κB的核定位情况,采用Elisa法检测细胞上清中MMP-9的含量。结果:（1）r CC16进入RTE细胞,主要分布于胞浆中,若于r CC16加入前,先给予网格蛋白介导内吞的抑制剂Chlorpromazine,则显示RTE细胞中红色荧光分布明显减少,提示进入细胞内的r CC16减少。（2）在加入r CC16前给予Chlropromazine,则r CC16对LPS诱导的NF-κB核定位的抑制作用减弱,即核内NF-κB含量仍较多,相应地,胞浆中NF-κB含量较r CC16干预组减少。（3）如果在加入r CC16前,给予网格蛋白抑制剂Chlropromazine,则发现r CC16对LPS诱导的MMP-9表达的抑制作用减弱,即上清液中MMP-9含量仍较多。结论:抑制网格蛋白介导的内吞后,r CC16对LPS诱导的NF-κB的活化和MMP-9表达的抑制作用明显减弱,初步证明网格蛋白介导的内吞作用参与了r CC16发挥抗炎作用的过程。