研究背景内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一类能分化为成熟的内皮细胞及心肌细胞,促进血管新生和改善心功能的干细胞。EPCs参与血管修复和血管新生,为治疗缺血性疾病提供了新的策略。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是调节EPCs功能最强的因子。VEGF与2型VEGF受体(KDR)相互作用而调节EPCs功能,包括内皮修复与血管新生。二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase, DDAH)能特异性的水解L-精氨酸的同类物非对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine, ADMA)。ADMA是一种主要的内源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)抑制物,能竞争性抑制NOS,减少一氧化氮(nitric oxide, NO)合成。研究发现,内皮细胞衰老和血管新生涉及DDAH/ADMA途径。人类沉默信息调节因子2(Silent information regulator 2, Sir2) SIRT1是Ⅲ型组蛋白去乙酰化蛋白,能引起基因表达沉默。研究发现,SIRT1通过DDAH/ADMA途径抑制内皮细胞衰老。文献报道,高糖诱导EPCs衰老涉及SIT1途径。基于DDAH/ADMA与SIRT1参与血管新生及细胞衰老的调节以及SIRT1介导DDAH/ADMA途径的效应,我们推测DDAH/ADMA可能通过VEGF/KDR途径参与EPCs分化与功能的调控,该作用可能涉及SIRT1途径。因此,本实验在体外培养人外周血来源EPCs研究了DDAH/ADMA对EPCs功能与衰老的影响。方法EPCs培养与鉴定：梯度离心加选择性粘附分离健康人外周血EPCs,用内皮基础培养基EBM-2培养EPCs。培养7天后鉴定,包括乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)与荆豆凝集素1(FITC-UEA-1)双染鉴定分化EPCS;流式细胞仪检测细胞CD133、CD34、CD45、KDR、vWF等标记物表达。DDAH对EPCs分化及功能调控及机制：提取分化第7天的EPCs,检测DDAH1和DDAH2表达；提取第7和17天EPCs,检测DDAH2、SIRT1表达。为了探讨DDAH2对EPCs功能的调控,运用pGCSIL-GFP-hDDAH2慢病毒转染EPCs沉默DDAH2表达；为了探讨SIRT1对DDAH2表达的调控,运用pGCSIL-GFP-hSIRT1慢病毒转染EPCs沉默SIRT1表达。提取细胞mRNA, Real-time PCR检测DDAH1、DDAP2、SIRT1、VEGF和KDR mRNA表达；流式细胞仪和Western Blot检测DDAH2和SIRT1蛋白表达；高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)检测细胞上清ADMA;β-半乳糖苷酶活性评价EPCs衰老程度；tube小管形成实验评价EPCs血管形成能力；纤维连接蛋白检测EPCs粘附能力。结果人外周血EPCs主要以DDAH2亚型表达为主,且随着EPCs分化时间延长而增加。干扰DDAH2表达能诱导EPCs衰老并抑制血管形成和粘附能力,抑制VEGF/KDR的mRNA表达。SIRT1能随着EPCs分化而表达增加,干扰SIRT1表达能下调DDAH2、VEGF/KDR表达,但对细胞上清ADMA浓度没有影响。结论DDAH2参与EPCs分化过程,并通过调节VEGF/KDR途径抑制EPCs的衰老,其作用机制涉及SIRT1途径。研究背景血管病变是糖尿病主要并发症之一。临床与动物实验发现糖尿病时,EPCs衰老率显著增加、功能受损。高糖能诱导EPCs衰老、血管形成能力减弱,导致糖尿病血管功能减弱、侧枝循环建立减少,引发心血管疾病。ADMA是一种新的心血管疾病预测因子,是内源性NOS抑制物,能竞争性抑制NOS,减少NO的合成。糖尿病时,细胞DDAH2表达降低、活性减弱,引起ADMA浓度增加并抑制NO生成。临床与动物实验证明,糖尿病时EPCs功能受损与NO浓度降低有关。细胞实验证明,ADMA能直接损伤EPCs功能。糖尿病或高糖孵育EPCs时,EPCs SIRT1表达下调,同时伴随细胞衰老和血管形成功能减退。内皮细胞实验发现,SIRT1可上调DDAH2表达,增加活性,促进ADMA水解,抑制内皮细胞自然衰老过程。本实验在2型糖尿病患者与培养EPCs细胞探讨了EPCs衰老与DDAH/ADMA之间的关系,以及该过程是否涉及SIRT1途径。方法临床研究：对照组与2型糖尿病患者组各40例。取外周静脉血,分离血浆与细胞。HPLC检测血浆ADMA浓度；梯度离心加粘附分离细胞EPCs,β-半乳糖苷酶活性评价细胞衰老,Real-time PCR法检测细胞DDAH2、SIRT1 mRNA表达。细胞实验：外源性给予葡萄糖(10,20,30 mmol/L)孵育EPCs建立高糖损伤EPCs细胞模型,以甘露醇(10,20,30 mmol/L)作为渗透压对照组,探讨高糖诱导EPCs衰老；构建pGC-FU-hDDAH2慢病毒探讨DDAH2抑制高糖诱导EPCs衰老；外源性给予ADMA(0, 0.3,0.6, 1pmol/L)探讨ADMA诱导EPCs衰老作用；运用SIRT1激动剂白藜芦醇(resveratrol, RSV)探讨SIRT1调节高糖诱导细胞衰老作用机制。梯度离心加粘附分离正常人外周血EPCs。细胞处理48h后,β-半乳糖苷酶活性评价细胞衰老。其他指标的检测为细胞处理24h时,Real-time PCR与Western Blot检测DDAH2、SIRT1 mRNA与蛋白表达,HPLC检测细胞上清ADMA水平,Griess法检测上清NO水平。结果2型糖尿病患者外周血EPCs衰老率显著升高,DDAH2与SIRT1 mRNA表达下调,同时伴随ADMA水平升高。葡萄糖能浓度依赖性地诱导健康人外周血EPCs衰老,下调EPCs DDAH2 mRNA和蛋白表达,增加培养上清ADMA水平并减少NO生成。渗透压对照组对细胞没有明显影响。过表达hDDAH2能抑制高糖诱导的EPCs衰老,并降低培养液中ADMA水平。外源性ADMA能浓度依赖性的诱导EPCs衰老。高糖能下调SIRT1 mRNA和蛋白表达。SIRT1激动剂RSV能显著抑制高糖诱导EPCs衰老,并且逆转高糖所致的DDAH2 mRNA表达下调及ADMA浓度升高。结论DDAH2/ADMA参与了高糖诱导的EPCs衰老,其作用涉及SIRT1途径。研究背景白藜芦醇(resveratrol, RSV)是一种多酚类的SIRT1天然激动剂。SIRT1参与糖代谢和胰岛素分泌的调节。糖尿病大鼠实验证明,RSV能上调VEGF与eNOS表达,抑制氧化应激反应,提高糖尿病大鼠骨髓细胞血管形成能力。细胞实验证明,RSV促进人外周血EPCs增殖、迁移以及血管新生。此外,RSV也能抑制TNF-α所致EPCs损伤。(E)-3,5,4’-三甲氧基-1,2-二苯乙烯((E)-3,5,4’-trimethoxystilbene, BTM-0512)是RSV的甲基化衍生物,其口服吸收率与半衰期均优于RSV。依据RSV对血管内皮和EPC保护作用以及SIRT1-DDAH2/ADMA对EPCs功能及衰老的调节作用,本实验在高脂饮食加单次腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)诱发的2型糖尿病大鼠模型与培养大鼠骨髓EPCs细胞,探讨RSV衍生物BTM-0512能否改善胰岛素抵抗,以及对EPCs衰老的影响及机制。方法动物实验：高脂饮食加单次腹腔注射STZ (35mg/kg)建立2型糖尿病大鼠模型。实验分为正常对照组、模型组、BTM-0512低剂量组(10mg/kg)和BTM-0512高剂量组(40mg/kg)。大鼠连续灌胃3周。取大鼠全血,分离血浆检测大鼠空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(Hb1AC)、葡萄糖耐量(OGTT)、HOME.IR、胰岛素敏感指数(IAI)、胰岛素分泌指数(IS)以及ADMA浓度。切取胸主动脉观测内皮依赖性舒张反应,免疫组化检测血管内皮DDAH2、SIRT1蛋白表达。采用梯度离心加选择性粘附分离大鼠骨髓EPCs细胞,β-半乳糖苷酶活性评价细胞衰老程度,Real-time PCR检测EPCs DDAH2、SIRT1 mRNA表达,tube小管形成实验检测EPCs血管形成能力,transwell小室评价EPCs迁移能力,纤维连接蛋白粘附法评价EPCs粘附能力。细胞实验：高糖处理EPCs,探讨BTM-0512 (0.3,1,3μM)抑制高糖诱导EPCs衰老及可能机制,给予SIRT1特异性阻断剂splitomicin (50μM)探讨SIRT1在BTM-0512对EPCs保护中作用。β-半乳糖苷酶活性评价细胞衰老,Real-time PCR检测DDAH2、SIRT1 mRNA表达,Western Blot检测DDAH2蛋白表达;HPLC检测细胞上清ADMA水平。结果BTM-0512能剂量依赖性降低2型糖尿病大鼠FBG和HblAC,改善HOME.IR和IAI,但对OGTT与IS没有影响。BTM-0512能剂量依赖性改善2型糖尿病大鼠血管舒张能力,抑制骨髓EPCs衰老,保护EPCs迁移、粘附及血管形成功能；BTM-0512能上调血管内皮及EPCs DDAH2、SIRT1表达。在培养EPCs, BTM-0512能剂量依赖性抑制高糖诱导细胞衰老,上调细胞DDAH2、SIRT1 mRNA表达并降低培养上清中ADMA浓度。SIRT1抑制剂splitomicin (50μmol/L)能取消BTM-0512对高糖诱导的EPCs衰老与EPCs DDAH2 mRNA表达下调,以及上清ADMA浓度升高的逆转作用。结论1.BTM-0512可降低2型糖尿病大鼠血糖,改善IR,并能改善血管舒张功能。2.BTM-0512能减轻高糖所致EPCs衰老,其机制涉及SIRT1-DDAH2/ADMA途径。