破骨细胞(osteoclast)通过行使骨吸收功能(bone resorption)参与维持人体骨骼(skeleton)的代谢平衡，而破骨细胞的分化和功能紊乱可引起多种人类疾病。在破骨细胞质膜(plasma membrane)上的V型质子泵ATP酶(vacuolar H+-adenosine5’-triphosphatase，V-ATPase)复合物，参与细胞外特定骨吸收区域的酸性微环境的形成和维持，为骨吸收所必需。多亚基(subunit)组成的V-ATPase的结构在进化中高度保守，其中很多亚基均具有多种亚型(subunit isoform)，由基因组上不同的基因编码。目前已经发现一些破骨细胞特异表达的亚基或亚型，其中有些已被证实和破骨细胞的骨吸收功能相关。Atp6v0d2(d2)是哺乳动物细胞质子泵d亚基的第二种亚型，我们和其他人的工作均证实它在破骨细胞中特异表达。尽管小鼠的基因敲除模型显示d2的缺失造成严重的骨硬化，但仍不清楚d2是否为质子泵的成员，而它与破骨细胞功能的直接联系也有待研究。　　破骨细胞的成熟(maturation)需要经历由单核的前体细胞(pre-osteoclasts)融合为多核细胞(multinucleated cells，MNCs)的过程。Atp6vOd2基因敲除小鼠体内缺乏成熟的多核细胞，不能用于研究d2在破骨细胞骨吸收功能中的作用。我们发现相对于前体细胞，d2的表达在已成熟的多核细胞中高度上调，提示其功能可能不仅限于调节前体细胞的成熟。为了获得d2缺失的成熟破骨细胞，我们建立了体外诱导分化的系统，用细胞因子RANKL(receptor activator of NF-κBligand)诱导骨髓细胞分化为成熟且有功能的破骨细胞，并利用慢病毒(lentivirus)介导d2的shRNA(small hairpin RNA)在不同的诱导分化时期(stage)对d2的表达进行抑制(knockdown)。在诱导分化早期(RANKL诱导第1天)，d2表达的抑制并未影响破骨细胞的正常分化，但影响了其细胞融合，这一结果与小鼠基因敲除实验一致。而在诱导分化后期(RANKL诱导第3天)，d2的缺失对破骨细胞的分化和成熟均无影响，胞外骨吸收区域也未受到破坏，这些现象与d2在破骨细胞体外诱导分化过程中的表达谱式吻合。接下来，我们发现体外诱导分化的破骨细胞其骨吸收功能依赖于d2的参与。在诱导分化的不同时期抑制d2的表达均显著影响了破骨细胞对骨片基质的骨吸收。进一步的研究发现d2对骨吸收功能的影响可能依赖于细胞质膜上的质子泵V-ATPase的作用，d2的缺失严重影响了质子泵对破骨细胞胞外区域的酸化功能。因此，d2可能参与了破骨细胞的胞外酸化功能的调节，这一点与另一个已知的破骨细胞特异的V-ATPase成员Atp6v0a3(a3)非常相似。为此我们检测了d2和a3的联系，体外免疫共沉淀实验和免疫荧光定位实验显示了d2和a3之间存在相互作用，而glutathioneS-transferase(GST) pull-down实验则首次证实d2和a3蛋白的氨基端部分存在直接结合。我们推测，很可能d2通过与a3的N端相互作用而与V-ATPase复合物整合。　　综上所述，我们的结果显示Atp6v0d2可能是一个具有双重功能的质子泵成员，不仅参与调节破骨细胞的成熟过程，而且还通过质子泵影响了破骨细胞的胞外酸化和骨吸收功能。因此d2可以作为一个潜在的药物靶点，用于研究和治疗骨吸收紊乱相关的人类疾病，如骨质疏松等。