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背景和目的： 肝细胞肝癌（HCC）是全球男性第5，女性第7的肿瘤，占所有肝脏肿瘤的85%~90%，而其中一半以上发生在中国，由于发病隐匿，发现时已为晚期，失去手术时机，而且其对化疗药抵抗以及复发率高，导致预后较差，生存期短。 肿瘤由肿瘤细胞和肿瘤微环境组成，肿瘤微环境又包括多种细胞因子与肿瘤干细胞组成。肿瘤生物学的研究中最具吸引力的理论之一是肿瘤干细胞（cancer stem cells， CSC）假说，该理论认为肿瘤干细胞在维持肿瘤的恶性增殖、侵袭、转移和复发等方面中起着决定性作用。在CSCs的生物标志物中，乙醛脱氢酶（ALDH）最为显著。 ALDH1和ALDH3受到较多关注，其高表达往往提示预后较差，但对ALDH9A1的研究却少之又少。在新英格兰发表的HCC基因表达谱与预后关系的研究中发现癌旁组织ALDH9A1的表达水平高提示预后良好。曾有研究发现ALDH9A1的1q24.1的变异代表了肾细胞肾癌的潜在风险位点。我们首先通过生物信息学分析ALDH9A1表达量与临床的关系，发现ALDH9A1高表达提示预后良好，进而通过体外、体内实验，发掘ALDH9A1抑制肝癌的机制，从而希望能为肝癌的治疗开辟新途径。 方法： 1. 生物学分析ALDH9A1表达量和临床的关系 我们通过http://www.oncolnc.org/网站收集了TCGA数据库中肝细胞肝癌患者的ALDH9A1 mRNA表达量和病人临床生存期、TNM分期、种族和年龄的相关数据，分析其相关性。此外，我们还通过生物信息学网站（http://merav.wi.mit.edu/）对不同肝癌细胞系的ALDH9A1的表达量进行了分析。 2. 不同肝癌细胞系中ALDH9A1的表达水平 通过RT-PCR检测三种肝癌细胞系Huh-7、HepG2和SK-HEP1以及正常肝细胞系HL-7702的ALDH9A1的表达水平，明确ALDH9A1高表达肝癌细胞系和低表达肝癌细胞系。 3. ALDH9A1对肝癌细胞系增殖、迁移和侵袭能力的影响 选择ALDH9A1低表达细胞株HepG2，对其转染pcDNA3.1-ALDH9A1质粒使其过表达，再选取ALDH9A1高表达细胞系SK-HEP1，对其siRNA干扰，并检测其mRNA表达水平，筛选出稳定的ALDH9A1过表达和低表达体系。随后采用克隆形成实验、划痕实验和transwell细胞迁移和侵袭实验检验ALDH9A1对肝癌细胞系增殖、迁移和侵袭的影响。 4. 生物信息学发掘ALDH9A1抑制肝癌机制 我们使用癌症基因组图谱（TCGA）数据集分析了ALDH9A1与其正相关和负相关基因的表达关系，并进一步阐明了ALDH9A1与TNFAIP1、NF-κB和Vimentin等基因表达的相关性。 5. ALDH9A1对EMT的影响 我们选取SK-HEP1细胞系的空白对照、ALDH9A1过表达两种细胞系，采用western blot 检测 E-cadherin、N-cadherin 及 Vimentin 的蛋白表达差异，以明确ALDH9A1对EMT的影响。 6. ALDH9A1抑制EMT的机制 通过Western blot方法来检测上下游分子的变化，从而阐明分子之间的相互关系。采用western blot检测SK-HEP1细胞系的空白对照、ALDH9A1过表达和低表达三种细胞系ALDH9A1、TNFAIP3和NF-κB的表达水平。我们通过向SK-HEP1细胞转染siRNA-TNFAIP1和pcDNA3.1-TNFAIP1质粒来阻断和激活TNFAIP1 ， western blot检测对照组、干扰组和激活组ALDH9A1、TNFAIP3和NF-κB的表达水平。我们通过向SK-HEP1细胞转染siRNA-p65和pcDNA3.1-p65质粒来阻断和激活p65，western blot检测对照组、干扰组和激活组ALDH9A1、TNFAIP3和NF-κB的表达水平。 7. 体内实验验证ALDH9A1对肝癌的抑制作用 将经过筛选后确定稳定转染了siRNA-ALDH9A1 和pcDNA3.1-ALDH9A1的SK-HEP1细胞进行常规计数后，每只小鼠注射的细胞总数为1×107。将36只BALB/c裸鼠按照鼠龄随机平均分成3组，把培养状态良好的肝癌细胞系siRNA-ALDH9A1低表达株、pcDNA3.1-ALDH9A1高表达株和未经转染的SK-HEP1细胞系皮下注射打入裸鼠皮下，观察6周后，乙醚麻醉裸鼠无痛处死，实施手术将肿瘤取出，测量肿瘤的重量，然后对所采集的数据进行分析。 8. 检测临床患者肝癌癌组织和正常组织ALDH9A1表达差异与临床指标相关性 收集在青岛大学附属医院介入医学中心2014.7-2015.6行TACE手术连续的46例肝细胞肝癌患者的癌组织和正常组织。采用RT-PCR的方法检测ALDH9A1在癌组织、正常组织的表达水平，并比较ALDH9A1在癌组织和正常组织中的表达差异。同时研究了ALDH9A1表达水平与患者生存期、T分期、年龄、性别及AFP水平之间的关系。 研究结果： 1. 生物信息学分析肝癌ALDH9A1表达和临床指标的关系 根据ALDH9A1表达情况以及肝癌患者生存期的统计结果进行Kaplan-Meier生存分析，结果显示生存期≤2500天时，ALDH9A1高表达组肝癌患者的总体生存期优于ALDH9A1低表达组，但生存期＞2500天时，ALDH9A1高表达组肝癌患者的总体生存期优于ALDH9A1低表达组的趋势不明显（P=0.07，P＞0.05）。进而，我们对该类患者进行细分，结果显示，ALDH9A1高表达组肝癌患者的1年、3年和5年生存率均明显优于低表达组，差异有统计学意义(P=0.03，P＜0.05)。 2. 肝癌细胞系中ALDH9A1表达差异 通过蛋白水平检测HepG2和Huh-7为ALDH9A1低表达细胞株，SK-HEP1为ALDH9A1高表达细胞株。因此在体外实验过程中我们选HepG2构建ALDH9A1过表达体系，选用SK-HEP1进行ALDH9A1干扰使其低表达构建ALDH9A1低表达体系。在体内实验时选用肝癌细胞SK-HEP1构建肝癌肿瘤模型。 3. ALDH9A1对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响 克隆形成实验结果显示转染siRNA-ALDH9A1的SK-HEP1肝癌细胞增殖能力则会增强，而转染pcDNA3.1-ALDH9A1质粒的HepG2肝癌细胞的增殖能力减弱，这说明ALDH9A1低表达可以增强肝癌细胞的增殖能力，ALDH9A1高表达能够抑制肝癌细胞增殖能力。transwell小室迁移和侵袭实验结果显示，转染siRNA-ALDH9A1的SK-HEP1肝癌细胞其迁移和侵袭能力则会增强，而转染pcDNA3.1-ALDH9A1质粒的HepG2肝癌细胞的迁移和侵袭能力减弱，该结果表明ALDH9A1低表达可以增强肝癌细胞的迁移和增殖能力，ALDH9A1高表达能够抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力。 4. 生物信息学发掘ALDH9A1抑制肝癌机制 我们使用癌症基因组图谱（TCGA）数据集分析了与ALDH9A1表达密切相关的基因，结果显示ALDH9A1与TNFAIP1、NF-κB和Vimentin蛋白质表达存在明显的相关性。我们发现TNFAIP1和ALDH9A1之间有显著的正相关性， NF-κB和ALDH9A1之间有着明显的负相关性，Vimentin和ALDH9A1之间有着明显的负相关性。 5. ALDH9A1抑制肝癌细胞EMT 在蛋白水平上， ALDH9A1 过表达组的 E-cadherin 表达高于空白对照组， N-cadherin及Vimentin的表达低于空白对照组，该结果说明ALDH9A1可以抑制肝癌细胞的EMT。 6. ALDH9A1抑制肝癌细胞EMT机制 在SK-HEP1细胞中，与对照组相比，转染siRNA-ALDH9A1下调ALDH9A1的表达，TNFAIP1表达降低，p65表达上升，转染pcDNA3.1-ALDH9A1上调ALDH9A1的表达，TNFAIP1表达升高，p65表达下降。与对照组相比，转染siRNA-TNFAIP1下调TNFAIP1的表达，ALDH9A1表达未变化，p65表达上升；转染pcDNA3.1-TNFAIP1上调TNFAIP1的表达，ALDH9A1表达未变化，p65表达下降。转染siRNA-p65下调p65的表达，ALDH9A1和TNFAIP1表达均未变化，转染pcDNA3.1-p65上调p65的表达， ALDH9A1和TNFAIP1表达亦未变化。综合上述结果，TNFAIP1是ALDH9A1的下游基因，ALDH9A1对TNFAIP1表达有上调作用，p65为TNFAIP1的下游基因，TNFAIP1对P65有下调作用，ALDH9A1上调TNFAIP1的表达，进而下调了p65的表达。 7. 体内实验验证ALDH9A1对肝癌的抑制作用 我们通过裸鼠皮下成瘤实验来进一步验证ALDH9A1的功能。肿瘤称重结果表明siRNA-ALDH9A1的肿瘤重量为0.55±0.05 g，pcDNA3.1-ALDH9A1组的肿瘤重量为0.22±0.03 g，而对照组肿瘤的重量为0.35±0.03 g，统计分析表明，三组数据差异显著（P＜0.05)。通过裸鼠的体内实验也说明ALDH9A1对肝癌的抑制作用。8. 检测临床患者肝癌癌组织和正常组织ALDH9A1表达差异与临床指标相关性 在46例HCC患者癌组织与正常组织相比，ALDH9A1低表达者40例，高表达者6例，低表达的趋势较为明显。ALDH9A1高表达患者的总体生存率优于低表达患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。T1+T2肝癌患者的ALDH9A1表达量低于T3+T4肝癌患者的ALDH9A1的表达量，差异有统计学意义（P＜0.05）。ALDH9A1表达量与年龄、性别和AFP表达水平进行统计学分析发现，ALDH9A1表达量与患者年龄有统计学差异（P＜0.05），ALDH9A1表达量与性别和AFP水平无统计学差异（P＞0.05）。 结论： 1．ALDH9A1高表达可能提示肝细胞肝癌预后良好 2．ALDH9A1可以抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。 3．ALDH9A1可以上调TNFAIP1的表达。 4．TNFAIP1可以抑制NF-κB介导的肝癌细胞的EMT过程。 5. ALDH9A1在肝癌癌组织中低表达的趋势明显，有可能为抑癌基因。