bFGF基因转染MSCs对COPD的修复作用及其机制研究

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目的:研究外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)对COPD造模大鼠的修复作用及其机制。方法:全骨髓贴壁细胞培养法分离、培养4-5周SD大鼠的BMSCs,并用CM-Dil做荧光标记。脂质体转染法将bFGF基因转染入BMSCs,用qRT-PCR及Western-blot测转染后bFGF基因及其目的蛋白的表达量。烟熏及脂多糖(LPS)气管滴入复合方法构建COPD大鼠模型。本课题分为5个实验组,共50只大鼠,随机平均分为正常对照组(NC组)、COPD对照组(PC组)、MSCs治疗组(M组)、pcDNA3.1-MSCs治疗组(P组)、bFGF-pcDNA3.1-MSCs治疗组(B组)。NC组:尾静脉注入3ml PBS液作阴性对照,PC组:造模后立即尾静脉注入3ml PBS液作阳性对照,M组:造模后立即尾静脉注入标记的第3代MSCs1×107/3ml PBS液,P组:造模后立即尾静脉注入标记的第3代pcDNA3.1-MSCs1×107/3ml PBS液,B组:造模后立即尾静脉注入标记的第3代bFGF-pcDNA3.1-MSCs1×107/3mlPBS液。以上各组大鼠在给药后30天统一采集动脉血行血气分析检测,行肺泡灌洗术收集肺泡灌洗液计数WBC及N%,并取大鼠肺组织制作冰冻切片观察BMSCs定植情况、HE染色观察其病理形态及测量MAN、MAA及MLI值。结果:1、成功分离大鼠BMSCs,流式细胞表型检测CD44、CD29阳性,CD34阴性,鉴定成功;2、bFGF基因转染BMSCs后用qRT-PCR检测其基因表达量,结果示转染了bFGF-pcDNA3.1质粒的BMSCs大量表达bFGF基因,较转染了pcDNA3.1空白质粒和未转染的BMSCs明显升高,差异具有显著统计学意义,说明bFGF基因成功转染入BMSCs中并可大量表达其目的基因;3、bFGF基因转染BMSCs后用Western-blot检测其蛋白表达量,结果示转染了bFGF-pcDNA3.1质粒的BMSCs大量表达bFGF目的蛋白,较转染了pcDNA3.1空白质粒和未转染的BMSCs明显升高,差异具有统计学意义,说明bFGF基因成功转染入BMSCs中并可大量表达其目的蛋白;4、标记的BMSCs移植入大鼠体内后28天肺组织病理可见红色点状的呈簇状分布的荧光,说明BMSCs在大鼠肺组织内成功定植;5、血气分析值:PC组、M组、P组、B组均有轻度低氧血症表现,无二氧化碳潴留及酸中毒表现,PC组、M组、P组、B组PO2、SaO2值均低于NC组,差异有统计学意义,其中M组、P组、B组PO2值均高于PC组,差异有统计学意义,而这3组之间差异无统计学意义,但B组PO2值较M组、P组有升高趋势;6、肺泡灌洗液WBC及N%计数:NC组、M组、P组、B组的WBC及N%计数均明显低于PC组,差异具有统计学意义,而其之间差异无统计学意义,其中B组WBC及N%计数较M组、P组相比无减少趋势,M组、P组、B组3个治疗组WBC及N%计数均稍高于NC组;7、肺组织病理形态参数MAN、MAA:PC组、M组、P组、B组MAN、MAA值均低于NC组,差异有统计学意义,其中M组、P组、B组MAN、MAA值均高于PC组,差异有统计学意义,而这3组之间差异无统计学意义,但B组MAN、MAA值较M组、P组有升高趋势;8、肺组织病理形态参数MLI值:PC组、M组、P组、B组均高于NC组,差异有统计学意义,其中M组、P组、B组MLI值均低于PC组,差异有统计学意义,而这3组之间差异无统计学意义,B组MLI值较M组、P组无下降趋势。结论:1.外源性bFGF基因成功转染入大鼠BMSCs并可大量表达其目的基因及目的蛋白;2.外源性BMSCs经尾静脉注射后可以到达COPD造模大鼠的肺组织并可成功实现在局部定植;3.外源性bFGF-pcDNA3.1-BMSCs移植治疗对COPD造模大鼠的修复效果较明确,较单纯造模组COPD程度有明显改善,较单纯BMSCs移植治疗组有增加趋势,但差异无统计学意义,因此尚不能推断bFGF有明显的修复COPD作用;4.单纯BMSCs移植治疗对COPD造模大鼠的修复效果较明确。
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