背景:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。肝细胞癌主要由慢性肝脏损伤引起的肝硬化发展而来,肝脏纤维化对血管具有破坏作用,肿瘤细胞迅速增殖消耗大量氧气,形成了肝癌局部的缺氧微环境。缺氧是肝细胞癌的主要特征之一,对于肝细胞癌的发生发展起着重要的调控作用。HIF-1是细胞缺氧应答的主要反应因子,由氧分压依赖的HIF-1α和非氧分压依赖的HIF-1β组成。缺氧条件下,稳定化的HIF-1α转运到核内并与HIF-1β结合形成异二聚体,该异二聚体通过结合到缺氧反应基因的启动子,促进缺氧反应基因的转录,参与调控肝癌的血管生成、侵袭转移和化放疗抵抗等行为。缺氧也会激活细胞内的NF-κB信号通路。NF-κB是由不同的亚基p65(RelA)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p105/p50)、NF-κB2(p100/p52)组成的一系列的二聚体转录因子,在调节细胞生存和免疫反应中发挥重要的作用。已有研究发现肝癌细胞中活化的NF-κB促进了炎性细胞因子(如IL-6、IL-1β)的表达,从而形成促癌的炎症微环境,参与肝癌的发生和发展。HIF-1和NF-κB的相互作用可能在维持细胞的缺氧应答中起着重要作用。以往的文献报道,NF-κB亚基p50和p65可以促进HIF-1α的转录;而HIF-1α也参与调节NF-κB的活化。但是,上述报道并没有全面地、动态地研究缺氧过程中HIF-1和NF-κB的相互作用。更好地了解缺氧肝癌细胞中HIF-1和NF-κB的相互作用及其分子机制,可能为肝癌的防治提供新的思路和策略。目的:研究缺氧条件下肝癌细胞中HIF-1和NF-κB的相互作用,并且阐明其中的分子机制。材料与方法:1、人肝癌细胞株Hep G2和Huh7经体外缺氧(1%O2)处理0-24h,qPCR和Western Blot检测HIF-1亚基HIF-1α、HIF-1β和NF-κB亚基p50、p65、c-Rel的表达2、vista软件预测hif-1α启动子是否存在p50、p65、c-rel亚基的结合位点,并且经染色质免疫共沉淀实验(chip)在hepg2和huh7细胞中验证。分别使用shnc、shp65、shc-rel慢病毒和mock、p65、c-rel过表达慢病毒转染hepg2细胞,转染的细胞经缺氧处理4h和24h,qpcr和westernblot检测hif-1α的表达。3、targetscan6.2预测hif1a3’-utr上游的mirna,mirgen2.0预测c-rel下游mirna,重叠预测结果得到候选mirna。qpcr检测缺氧肝癌细胞中候选mirna的时序表达。转染shnc、shc-rel的hepg2细胞经缺氧处理0h、4h、24h,qpcr检测候选mirna的表达。过表达候选mirna的细胞株经缺氧处理4h,qpcr、westernblot检测hif-1α的表达。荧光素酶实验验证候选mirna与hif1a3’utr结合能力。4、westernblot检测缺氧肝癌细胞中mirna合成酶dicer1的表达,使用shnc、shdicer1慢病毒转染hepg2细胞,转染的细胞经缺氧处理0h、4h、24h,qpcr检测mir-93和mir-199a-5p的表达。5、转染shnc和shdicer1的hepg2细胞经缺氧处理0h、4h、24h,qpcr和westernblot检测hif-1α的表达。6、vista软件预测dicer1的启动子是否存在hif-1、p50、p65和c-rel的结合位点,并且经染色质免疫共沉淀实验(chip)在hepg2和huh7细胞中验证;vista软件预测p50、p65、c-rel启动子是否存在hif-1的结合位点。使用shnc和shhif1a慢病毒转染hepg2细胞,转染的细胞经缺氧处理0h、4h、24h,qpcr检测p50、p65、c-rel和dicer1、mir-93、mir-199a-5p的mrna表达,westernblot检测p50、p65、c-rel和dicer1的蛋白表达。结果:1、肝癌细胞中nf-κb亚基p50、p65、c-rel的mrna和蛋白水平随着缺氧时间延长而升高(0-24h);hif-1α的mrna水平随着缺氧时间延长而升高,蛋白水平在短期缺氧时(0-4h)升高而持续缺氧时(4-24h)降低。(1)hepg2和huh7细胞中hif-1亚基hif-1α和nf-κb亚基p50、p65、c-rel的mrna水平随缺氧时间(0-24h)的延长而增加,而hif-1亚基hif-1β的mrna水平则基本不变。(2)hepg2和huh7细胞中p50、p65、c-rel的蛋白水平随缺氧时间的延长而增加(0-24h),hif-1β的蛋白水平基本保持不变,而hif-1α的蛋白水平在短期缺氧时(0-4h)增加,在持续缺氧时(4-24h)降低。2、nf-κb亚基p50和p65与hif-1α的启动子直接结合并促进hif-1α的表达;而持续缺氧时(4-24h)c-rel间接地抑制hif-1α的表达。(1)hif1a启动子上没有c-rel的结合位点,但是有p50和p65的结合位点,其中s1(chr14:62162387-62162397,序列:aggggtttccc)是p50和p65共有的结合位点,而s2(chr14:62162718-62162728,序列:ccgggctcccc)是p65独有的结合位点。(2)缺氧4h的hepg2细胞中,p65下调引起hif-1α的mrna和蛋白水平下降,而c-rel下调对hif-1α的mrna和蛋白水平无影响;缺氧24h的hepg2细胞中,p65下调导致hif-1α的mrna和蛋白水平下降,而c-rel下调对hif-1α的mrna水平无影响,却引起hif-1α的蛋白水平增加。(3)缺氧4h和24h的hepg2细胞中,p65过表达引起hif-1α的mrna和蛋白水平升高,而c-rel过表达引起hif-1α的mrna和蛋白水平降低。3、nf-κb亚基c-rel下游的mir-199a-5p和mir-93直接结合3’utr抑制hif-1α的表达。(1)hif1a3’-utr上游和c-rel下游的重叠的6个候选mirna为:mir-199a-5p,mir-18a,mir-20a,mir-93,mir-17和mir-106b。hepg2细胞中mir-17的表达水平随着缺氧时间延长而稳定升高,mir-199a-5p、mir-93和mir-106b的表达在短期缺氧时(0-4h)减少,而在持续缺氧时(4-24h)增加。mir-20a的表达在缺氧0-2h减少,在缺氧3-24h增加。mir-18a的表达在缺氧2-8h和24h减少,但是在缺氧12h增加。(2)常氧、缺氧4h、缺氧24h的hepg2细胞中,下调c-rel引起mir-199a-5p、mir-18a、mir-20a、mir-93、mir-17的表达下降,对mir-106b的表达无影响。(3)缺氧4h的hepg2细胞中,mir-93、mir-199a-5p过表达显著减少了hif-1α的mrna和蛋白表达,mir-18a过表达减少了hif-1α的蛋白表达但不影响hif-1α的mrna表达,过表达mir-17对hif-1α的mrna和蛋白水平无影响。(4)mir-93、mir-199a-5p可显著减少hif1a3’utr的荧光素酶活性,而mir-18a、mir-17对hif1a3’utr的荧光素酶活性没有影响。4、肝癌细胞中mirna合成酶dicer1的表达在短期缺氧时(0-4h)下降,而在持续缺氧时(4-24h)上升;dicer1正向调节mir-93和mir-199a-5p的表达。(1)hepg2细胞中dicer1的蛋白水平在短期缺氧时(0-4h)下降,而在持续缺氧时(4-24h)显著升高。(2)常氧和缺氧24h的hepg2细胞中,dicer1下调引起mir-93和mir-199a-5p的表达显著下降。5、Dicer1负向调节HIF-1α的表达,且该调节机制主要在持续缺氧时(4-24h)起作用。缺氧0h和4h的Hep G2细胞中,Dicer1下调对HIF-1α的mRNA和蛋白水平无影响;缺氧24h的Hep G2细胞中,Dicer1下调引起HIF-1α的mRNA和蛋白水平显著升高。6、缺氧肝癌细胞中HIF-1结合到p50、p65、c-Rel和Dicer1的启动子促进其表达,进而引起miR-93和miR-199a-5p表达上调。(1)Dicer1的启动子上不存在p50、p65、c-Rel结合位点,但是存在HIF-1的结合位点,该结合位点位于Dicer1启动子的chr14:95623615-95623634(序列:CGGCGCGCGCGTCACAGCCC)位点。(2)p50、p65、c-Rel启动子上存在HIF-1结合位点,p50启动子存在的HIF-1α结合位点为Chr4:103423385-103423404(序列:GCAGAAGTGCTTGTCAGTCC),p65启动子存在的HIF-1α结合位点为Chr11:65430400-65430419(序列:CCGCCGTCGCGTCACTGCCC),c-Rel启动子上存在的HIF-1α结合位点为Chr2:61109146-61109165(序列:CAGGGTTTGCGTGCAGAATC).(3)缺氧4h和24h的HepG2细胞中,HIF-1α下调引起p50、p65、c-Rel和Dicer1、miR-93、miR-199a-5p的mRNA水平降低,同样引起p50、p65、c-Rel和Dicer1的蛋白水平显著下降。结论:1、短期缺氧时(0-4h)HIF-1的急剧增加促进了NF-κB亚基p50、p65、c-Rel和mi RNA合成酶Dicer1的表达,p50和p65进一步促进HIF-1α的转录。2、短期缺氧时(0-4h)上调的c-Rel和Dicer1促进下游mi R-199a-5p和mi R-93表达,mi R-199a-5p和mi R-93在持续缺氧时(4-24h)靶向结合到HIF1A的3’UTR从而在转录后水平抑制HIF-1α的表达。