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口腔内科中，牙体牙髓病的诊治一直以来都是依赖于根管治疗技术及其相关辅助设备的发展，人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)是目前关注较多且较常应用的一种种子细胞。牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)的表达一直以来都是牙髓再生研究中的热点。 MicroRNA(miRNA)即是我们常见的小RNA之一。其长度一般在18-25nt之间，经过较长的初级转录物在一系列的核酸酶的剪切加工后形成，随后可以组装进入RNA诱导的沉默复合体，然后根据互补程度的大小来指导沉默复合体降解靶基因mRNA或者抑制相关mRNA的翻译，从而起到抑制目的基因表达的作用。经证明miR-586可以靶向调控DSPP的表达，抑制miR-586的表达，可导致DSPP表达上调，从而促进矿化诱导。 基于本课题组的前期研究结果，本实验将构建miR-586表达抑制的慢病毒，并将其转染入牙髓干细胞中且稳定表达。将此稳定转染的牙髓干细胞与内皮前体细胞进行共培养，分别对共培养物进行矿化诱导及成血管诱导培养，观察其各项矿化特性及血管形成特性，观察miR-586表达抑制处理后的此共培养物，是否能在不影响内皮前体细胞血管生成特性的基础上，同时促进共培养物向成牙本质细胞向分化。本文研究内容分为几个部分： 第一部分： 目的： 人牙髓干细胞和内皮前体细胞的分离培养与鉴定 方法： 1.本实验采用改良的组织块酶消化法分离和培养人牙髓干细胞，牙髓组织取材于成年人健康的第三磨牙或因正畸治疗需要而拔除的前磨牙，取出其牙髓组织进行培养，观察其形态及生长状态。 2.采用多种方法对人牙髓干细胞的干性进行检查:有限稀释法纯化人牙髓干细胞及细胞克隆鉴定;采用流式细胞仪检测及分析干细胞表面标记物(CD29、CD44、CD90);对培养的人牙髓干细胞进行多向分化潜能鉴定，包括成骨矿化诱导、成脂诱导及成软骨诱导，在经诱导21天后，分别进行茜素红染色、尼罗红染色及阿利新兰染色。 结果： 1.人牙髓干细胞的形态及生长状态的镜下观察:初代爬出的细胞呈长梭形，待细胞增殖至细胞培养瓶瓶底面积80％或多数牙髓组织块周围爬出的细胞已长至复层生长时，传代培养，传代后的细胞继续增殖，可呈旋涡状或放射状排列，此时可再次传代。细胞生长状态正常情况下，一般3-5天可传一代。 2.流式细胞仪检测人牙髓干细胞结果显示:间充质干细胞表面标记物CD29、CD44、CD90均呈阳性表达，表达率分别为94.70％、100％和99.90％;造血干细胞表面标记物CD34、CD45阳性表达率分别为0.16％、0.47％。 3.原代培养所得的人牙髓干细胞具有多向分化潜能。细胞经成骨矿化诱导后，茜素红染色可见大小不等的红褐色矿化结节形成;细胞经成脂诱导，尼罗红染色后可见细胞内红染;细胞经成软骨诱导，阿利新兰染色后可见蓝染。 4.内皮前体细胞生长形态:复苏所得细胞为第4代细胞，呈铺路石状排列，增殖速度快，2天传一代。 结论： 采用改良的组织块酶消化法分离和培养人牙髓干细胞，能保证较高的原代牙髓干细胞的游出率，培养出的原代细胞形态良好，呈长梭形，透明饱满，增殖速度快，具有克隆生长的特性，高表达间充质干细胞表面分子标记物，极低表达造血干细胞表面分子标记物，具有向成牙本质细胞、脂肪样细胞及软骨细胞分化的潜能，其特性与骨髓间充质干细胞类似，可定义其是一类牙髓组织来源的，具有多向分化潜能和干细胞特性的细胞群。受赠的内皮前体细胞复苏后经过鉴定，具有分化为成熟的内皮细胞的潜能。 第二部分： 目的： miR-586表达抑制慢病毒稳定转染人牙髓干细胞 方法： 1.miR-586表达抑制慢病毒载体的制备，载体使用的是吉凯基因公司的GV慢病毒载体系列、pHelper1.0载体和pHelper2.0载体三质粒组成。本实验所要构建的miR-586表达抑制慢病毒所采用的是GV-232载体。利用载体进行miR-586表达抑制慢病毒的包装以及对其进行滴度检测。 2.慢病毒感染预实验:嘌呤霉素梯度筛选实验，找出嘌呤霉素用于人牙髓干细胞筛选的最优浓度，用于后续慢病毒稳定转染细胞株的筛选。 结果： 1.获取miR-586表达抑制慢病毒，对阳性克隆的测序结果进行blast比对发现，设计的miR-586反义互补序列可以和成熟体miR-586的序列互补配对。miR-586表达抑制慢病毒的滴度为3E+8TU/ml。 2.嘌呤霉素用于筛选人牙髓干细胞的最优浓度为2μg/ml，此浓度下的嘌呤霉素能在3天内杀灭所有人牙髓干细胞。 3.miR-586表达抑制慢病毒感染人牙髓干细胞的MOI为50时能达到90％以上感染效率。感染条件是人牙髓干细胞在Complete Medium+5μg/ml polybrene下容易被感染。 结论： 牙髓干细胞与内皮前体细胞共培养，在细胞数量为1∶1，且培养液混合比例为1∶1的条件下，共培养物生长状态良好，两种细胞均增殖较快。成功构建了miR-586表达抑制的慢病毒载体，并成功感染人牙髓干细胞。筛选出了稳定转染miR-586表达抑制慢病毒的人牙髓干细胞，成功构建的此稳转细胞模型可用于后续成牙本质特性及成血管特性的实验研究。 第三部分： 目的： miR-586表达抑制对牙髓干细胞/内皮前体细胞共培养中成牙本质向分化的影响 方法： 将转染后的人牙髓干细胞与内皮前体细胞进行共培养，混合比例为1∶1，培养液将含10％FBS的DMEM与10％FBS的EGM-2 MV混合，比例为1∶1。实验分为5组，分别为:DPSCs组、DPSCs(miR-586 inhibition)组、DPSCs/EPCs组、DPSCs(Empty Vector,EV)/EPCs组、 DPSCs(miR-586inhibition)/EPCs组，后文叙述中5组细胞将简化为:DPSCs组，DPSCs(586)组，DPSCs/EPC组，DPSCs(EV)/EPCs组和DPSCs(586)/EPCs组。5组细胞均进行不同时间点（3天、7天、14天）的矿化诱导。 结果： 1.MTT结果显示，DPSCs(586)组OD值在培养第3天时比DPSCs(EV)组显著升高(P＜0.01)，在培养第5和7天时，DPSCs(586)组OD值比DPSCs(EV)组显著升高(P＜0.05)。 2.茜素红染色结果显示:经矿化诱导14天后，DPSCs/EPCs组、DPSCs(586)/EPCs组、DPSCs(586)组、DPSCs(EV)/EPCs组形成的红褐色矿化结节均比对照组DPSCs组多且深，其中DPSCs(586)/EPCs组形成的矿化结节最多，颜色最深。 结论： 成功构建了miR-586表达抑制人牙髓干细胞/内皮前体细胞的细胞共培养模型，可作为较好的种子细胞组合，用于牙髓再生研究。内皮前体细胞共培养及miR-586表达抑制的同时应用，对于定向诱导人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化具有协同促进作用。将内皮前体细胞与人牙髓干细胞进行直接接触共培养，能促进人牙髓干细胞的成牙本质向分化。 第四部分： 目的： miR-586表达抑制对牙髓干细胞/内皮前体细胞共培养中成血管的影响 方法： 1.将转染后的人牙髓干细胞与内皮前体细胞进行共培养，混合比例为1∶1，培养液混合比例为1∶1，共分为4组，分别为: EPCs组、DPSCs/EPCs组、DPSCs(EV)/EPCs组、DPSCs(586)/EPCs组。4组均进行7天的成血管诱导培养。 2.7天后收集4组细胞，分别进行后续实验:(1)Tube formation assay; (2)qRT-PCR检测成血管相关因子CD34、VEGF、Flk-1和SDF-1的表达; (3) Western Blot检测5组细胞中VEGF的蛋白表达情况，加入了DPSCs组作为对照。 结果: 1.Tube formation assay结果显示:DPSCs/EPCs组、DPSCs(EV)/EPCs组、DPSCs(586)/EPCs组形成的管腔结构比EPCs组的管腔结构连接处更为紧密和牢固，管腔连接处形成了特殊的复合体，面积更大，管腔总长度更长，平均管腔周长也更长，并且这三组所形成的管腔的持续时间能达到92小时，而EPCs组形成的管腔结构在48小时就出现了降解的情况。 2.qRT-PCR结果显示:CD34、VEGF、Flk-1、SDF-1在DPSCs/EPCs组、DPSCs(EV)/EPCs组、DPSCs(586)/EPCs组这三个共培养组的表达量均显著高于EPCs单细胞组(P＜0.05)。多重比较结果显示，3个共培养组之间无显著差异(P＞0.05)。 结论: miR-586表达抑制对于人牙髓干细胞/内皮前体细胞共培养物的成血管特性有间接促进作用。将人牙髓干细胞与内皮前体细胞进行直接接触共培养，能促进内皮前体细胞的血管新生。人牙髓干细胞/内皮前体细胞共培养物形成的血管样结构的持续时间比单细胞培养的内皮前体细胞明显增加，并会在其管腔连接处形成更为稳固的复合体。