野芥菜(wild Brassica juncea)为十字花科芸薹属一年或两年生杂草,经过查阅文献和实地调查发现,野芥菜已广泛分布于我国16个省的麦田、油菜田、路边、花坛及荒地等生态环境中,危害日趋严重。现有芥菜的研究主要集中于栽培种,对野生种的研究非常少,目前野芥菜的分类地位尚没有确定,因此拉丁名的使用不一致,常使用的拉丁名有B. juncea (L.) Czern. et Coss、B. juncea var. gracilis Tsen et Lee;同时全国范围内野芥菜的遗传多样性及结构不清楚,因此有必要对全国范围内的野芥菜的“种”以下分类地位、遗传多样性及不同地区间的遗传结构进行研究,为探讨野芥菜的起源和进化提供理论依据。本实验室人员对野芥菜分布地区进行系统调查,并采集了来自于中国13个省份的25个居群,每个居群10个个体共250份野芥菜植株标本和种子样本。此外,还收集了德国野芥菜、美国野芥菜、油用的大叶芥油菜(B. juncea var. juncea)、菜用的芥菜雪里红(B. juncea var. multiceps)、禹氏三角中的3个基本种芸薹(B. campestris)、黑芥(B. nigra)、甘蓝(B. oleracea)以及复合种欧洲油菜(B. napus)和埃塞俄比亚芥(B.carinata)的植株。在南京农业大学牌楼试验基地对上述材料进行种植,采集幼苗期叶片提取DNA,对上述材料的核基因组ITS(内转录间隔区)和RPS2(抗丁香假单胞菌基因)序列进行扩增,并结合从NCBI库中下载的多裂叶芥(B. juncea var. multisecta)、榨菜(B. juncea var. tumida)、大头菜(B. juncea var. megarrhiza)、小叶芥油菜(B. juncea var. gracilis)的ITS序列和外类群拟南芥(Arabidopsis thaliana)的ITS和RPS2序列进行野芥菜分类地位研究；自行开发了12对野芥菜核基因组的简单重复序列标记(SSR, simple sequence repeat),利用其中的11对引物对25个野芥菜居群进行了遗传多样性及遗传结构分析。对上述材料的ITS和RPS2序列进行分析,并采用最大简约法(Maximum parsimony method, MP)构建系统进化树进行聚类分析。结构表明ITS序列比对长度为614bp,变异位点为56bp(9.12%),简约信息位点为34bp(5.53%)；RPS2序列比对长度为1019bp,变异位点为116bp(11.38%),简约信息位点为87bp(8.54%)。在MP树上,野芥菜及其近缘种可聚为2个分支。第一分支为甘蓝与埃塞俄比亚芥,支持率为81%；其他物种以58%的支持率聚为第二分支。第二分支内,又分为2个亚分支,美国野芥菜、德国野芥菜、黑芥及小叶芥油菜、榨菜以84%的支持率形成第一亚分支；其余物种聚合成第二亚分支,支持率为84%。第二亚分支中芸薹、欧洲油菜、西藏野芥菜以52%支持率聚合,大叶芥油菜及雪里红、多裂叶芥、大头菜与除西藏野芥菜外的其他野芥菜各居群呈现平行的姐妹类群关系。上述系统发育树表明中国野芥菜与雪里红、多裂叶芥和大叶芥油菜亲缘关系较近。结合前人的观点,即野芥菜是芥菜型油菜的逸生种或芥菜型油菜的野生种,本实验更倾向于使用B. juncea var. juncea作为野芥菜的拉丁名或把野芥菜作为新的变种进行重新定名。应用RPS2序列对25个中国野芥菜居群进行鉴别位点分析,结果显示,根据10个位点,可将25个居群分为2大类,一类为稳定具有这10个位点的采自于西藏、新疆、青海、四川、贵州、河南地区的12个居群,另一类为这10个位点分别发生了相同变异的采自于陕西、江西、湖北、湖南、安徽、江苏、浙江地区的13个居群。由于野芥菜居群间的ITS序列没有差异,因此以ITS和RPS2序列共同构建的系统发育树的支持率较低,无法清晰地揭示野芥菜居群间的遗传关系。因此选择使用有变异位点的RPS2序列单独构树。以拟南芥为外类群基于RPS2序列使用UPGMA法构建系统进化树,结果显示黑芥和2个德国野芥菜居群聚为第一分支,中国野芥菜各居群、栽培芥菜(大叶芥油菜、雪里蕻)和芸薹聚为第二分支。第二分支可分为三个亚支,其中芸薹、西藏野芥菜和新疆野芥菜聚为第一亚支；河南、四川、贵州、青海4省的8个野芥菜居群聚为第二亚支；湖南、湖北、江西、陕西、安徽、江苏、浙江7省13个野芥菜居群和2个栽培芥菜品种(大叶芥油菜和雪里红)聚为第三亚支。RPS2序列的单倍型分析结果与上述结果相同。基于上述系统发育树认为中国野芥菜的RPS2序列起源于西藏和新疆地区。通过RPS2序列可知,25个中国野芥菜居群间的遗传距离为0-0.033,核苷酸多样性指数Pi为0.01302,居群间遗传分化系数Nst为0.959,基因流Nm为0.01,显示了中国分布野芥菜居群间遗传变异达95.93%,居群内遗传变异仅为4.07%,居群问基因交流少。采用双抑制PCR法设计野芥菜的微卫星引物,用以研究野芥菜各居群的群体遗传学。将设计的12对引物在四川南充和江苏江浦两个居群各20个个体中扩增,结果表明12对微卫星引物均具有多态性。每个位点的等位基因的范围是4-27个,平均等位基因数是15.2个。利用设计的微卫星引物对野芥菜各居群遗传变异和遗传结构进行研究,对探讨野芥菜遗传多样性和进化模式具有重要意义。本研究利用上述12对中的11对多态性的SSR引物对25个中国野芥菜居群进行遗传多样性、居群遗传结构的研究。研究结果显示,在中国野芥菜群体中共检测到了90个等位基因,表明其具有较高的遗传多样性水平。Shannon多样性指数(I)在0.355-0.610之间,平均为0.45。遗传多样性指数(HS)在0.241-0.503之间,平均为0.319。NJ聚类分析和主成分分析(PCoA)结果表明25个居群分化为两个独特的遗传谱系(南谱系Southern Lineage和北谱系Northern Lineage),并具有特定的地理分布。北谱系包括起源地西藏、新疆,安徽北部和江苏北部和黄河流域的青海、陕西、河南。南谱系包括长江流域的四川、贵州、江西、湖北、湖南、浙江。在不考虑安徽、江苏长江以北的野芥菜居群的情况下,结合遗传多样性指数,推测野芥菜起源于西藏和新疆地区,由西向东,分别沿黄河流域和长江流域进行扩散。位于长江流域北部的安徽(巢湖、滁州)、江苏(南通、江浦)野芥菜居群却与黄河流域居群亲缘关系近的原因,有待于进一步探讨。