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目的：替莫唑胺(TMZ)是一种新型口服烷化剂化疗药,具有一定的疗效及安全性。多年临床研究证实替莫唑胺能改善恶性神经胶质瘤患者预后,并成为对恶性神经胶质瘤治疗的一线化疗药物。因为其及耐药性的存在,恶性胶质瘤患者的临床预后仍然较差。目前替莫唑胺治疗胶质瘤的相关分子机制仍不完全明确,从基因和miRNA层面寻找潜在的靶标分子,可改善常规疗法的效果。miRNA是非编码调控RNA家族,其5’端核苷酸可与靶基因mRNA3’非翻译区(UTR)以完全或不完全方式结合,通过抑制翻译、裂解mRNA和／或脱腺苷调控靶基因。人类配对盒基因6(PAX6)是高度保守的转录调控因子,已有多项研究表明其在胶质瘤中均作为抑癌因子发挥其生物学作用。在胶质瘤细胞中,生长因子、细胞内代谢和细胞外信号分子均通过PI3K/AKT信号通路来调控其生长和增殖。本课题旨在通过研究替莫唑胺抑制U251细胞增殖作用,明确PAX6是否参与替莫唑胺治疗机制,进一步寻找对替莫唑胺化疗敏感靶向调节PAX6的miRNA,探讨miRNA/PAX6是否参与这一机制,以及是否通过调控P13K/Akt通路参与替莫唑胺抑制U251细胞增殖机制。方法：(1)分别用不同浓度的替莫唑胺处理U251细胞,其终浓度分别为0,100,200,400μmol/L,用QPCR及Western blot检测PAX6的表达水平。(2)用PAX6-shRNA转染胶质瘤细胞U251细胞,用QPCR及Western blot检测PAX6的表达水平。(3)用PAX6ORF clone转染U251细胞,用QPCR及Westernblot检测PAX6的表达水平。(4)设置分组：pcDNA3.1组、PAX6ORF clone组、TMZ+pcDNA3.1组和]MZ+PAX6ORF clone组分别处理U251细胞,用MTT及BrdU实验检测各组细胞增殖曲线。(5)设置分组：Con-shRNA组、PAX6-shRNA组、TMZ+Con-shRNA组、TMZ+PAX6-shRNA组,分别处理U251细胞,用MTT及BrdU实验检测各组细胞增殖曲线。(6)采用生物信息学软件miRanda及targetscan预测可能靶向PAX6的miRNAs,筛选出最可能的miRNA。(7)分别用不同浓度的替莫唑胺处理U251细胞,其终浓度分别为0,100,200,400μmol/L,用QPCR检测miR-223、miR-590-3p、 miR-190、miR-190b、miR-7的表达。(8) miR-223mimics转染U251细胞后,用QPCR检测miR-223的表达；miR-223Sponge转染U251细胞后,用QPCR检测miR-223的表达。(9)设置分组：Vector组、miR-223Sponge组、TMZ组、TMZ+miR-223Sponge组,分别处理U251细胞,用MTT及BrdU实验检测各组细胞增殖曲线。(10)设置分组：miR-SCR组、miR-223组、TMZ+miR-SCR组、TMZ+miR-223组,分别处理U251细胞,用MTT及BrdU实验检测各组细胞增殖曲线。(11)利用双荧光素酶报告系统验证miR-223与PAX6的靶向调控关系。(12)设置分组：Vector+Con-shRNA组、Vector+PAX6-shRNA组、niR-223Sponge+Con-shRNA组、miR-223Sponge+PAX6-shRNA组,分别处理U251细胞,用MTT及BrdU实验检测各组细胞增殖曲线。(13)设置分组：miR-SCR组、TMZ+miR-SCR组、TMZ+miR-223组,分别处理U251细胞,分别用VWestern blot检测IAX6、PI3K.p-P13K、Akt、p-Akt蛋白的表达。(14)设置分组：miR-SCR+PCDNA3.1组、miR-223+PAX6ORFclone组和miR-223+PCDNA3.1组分别处理U251细胞,分别用Westernblot检测PAX6、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达。结果：(1)浓度为100,200,400μmol/L时,相较于对照组中PAX6mRNA及蛋白表达显著升高,当TMZ浓度为400μmol/L时表达差异最为显著。(2)PAX6-shRNA组相较于Con-shRNA组PAX6mRNA及蛋白明显下调。(3) PAX6ORF clone组相较于pcDNA3.1组PAX6mRNA及蛋白明显上调。(4) PAX6ORF clone组,U251细胞生长受到明显抑制；TMZ+PAX6ORF clone组与TMZ+pcDNA3.1组相比较,U251细胞生长受到抑制更加明显。(5)PAX6-shRNA组,U251细胞增殖受到显著促进。TMZ+Con-shRNA组,U251细胞增殖受到明显抑制。Con-shRNA组与TMZ+PAX6-shRNA两组之前细胞增殖情况无统计学意义。(6)筛选出靶向PAX6的可能iRNA:miR-223、miR-590-3p、 miR-190、miR-190b、miR-7。(7)浓度为100,200,400μmol/L时,相较于对照组niR-223、 miR-590-3p表达显著下降,miR-190、miR-190b、miR-7表达显著升高,当TMZ浓度为400μtmol/L时表达差异最为显著。(8)转染后U251细胞,miR-223mimics组与miR-SCR mimics相比较,miR-223的表达明显上调；miR-223Sponge组与Vector组相比较,miR-223的表达明显下调。(9) miR-223Sponge组,U251细胞增殖受到抑制。TMZ组,U251细胞增殖受到抑制。TMZ+miR-223Sponge组,U251细胞抑制程度更加明显。(10)miR-223组,U251细胞增殖受到显著促进。TMZ+miR-SCR组,U251细胞生长受到显著抑制。TMZ+miR-223二者联合处理组,miR-223可回复TMZ对U251细胞的抑制作用。(11)双荧光素酶报告检测发现,miR-223可以直接结合PAX6mRNA的3’-UTR区。(12) miR-223Sponge+Con-shRNA组,U251细胞生长受到抑制。Vector+PAX6-shRNA组,U251细胞生长受到促进。miR-223Sponge+PAX6-shRNA联合处理,可回复miR-223Sponge的抑制作用。(13)miR-223可激活P13K/Akt通路活性,而miR-223与替莫唑胺联合处理,可逆转替莫唑胺对P13K/Akt的抑制作用。(14)miR-223可激活P13K/Akt通路活性,而miR-223与PAX6ORF clone联合处理,可逆转miR-223对P13K/Akt的激活作用。结论：(1)PX6-ORF clone抑制U251细胞的增殖,对替莫唑胺的抗癌效应有协同作用,增强替莫唑胺的化疗敏感性。(2)沉默miR-223抑制U251细胞增殖,对替莫唑胺的抗癌效应有协同作用,增强替莫唑胺的化疗敏感性。(3)替莫唑胺通过调控miR-223/PAX6,抑制P13K/Akt通路活性,起到抑制胶质瘤细胞增殖的作用。