目的：造血干细胞(Hematopoietic stem cells, HSCs)是最早在临床治疗中进行常规应用的的干细胞类型,其具有自我更新及多向分化潜能。尽管HSCs移植己成熟地应用于治疗各种类型血液系统恶性疾病,但由于传统移植方法中,来源于骨髓或动员后外周血中的HSCs进行移植时需要供体与受体人白细胞抗原(Human leukocyte antigen, HLA)配型全相合,因而导致其在临床应用中仍受到了较大限制。脐带血作为一种新的HSCs来源具有多种临床应用优势,包括其可允许HLA部分错配,同时移植后移植物抗宿主病(GVHD)的发生率大大降低。但由于单份脐带血中HSCs含量较低因而目前仅可满足儿童患者及体重较低的成人患者需要。进入细胞周期是HSCs进行自我更新及扩增的最后一步,而G1期的调控可能是自我更新过程的关键一步。因此,为满足临床治疗需求以及研究HSCs扩增和自我更新的调控机制,我们选择细胞周期调控关键蛋白p18作为靶点,设计筛选出一系列潜在的可使HSCs体外扩增小分子化合物,并进一步对其内在机制进行研究。方法：首先,我们采用慢病毒感染方式敲降人脐带血HSCs中p18的表达,并对敲降后的细胞分别进行干细胞表型分析以及体外造血功能检测。随后,我们以p18作为靶点,根据前期计算机虚拟筛选的结果获得一系列小分子化合物,并利用小鼠HSCs单细胞集落形成实验对这些化合物的造血扩增作用进行了初步分析筛选。当确认该类小分子化合物的造血扩增作用后,我们又用这些小分子化合物处理人脐带血HSCs,进而筛选出一个效果最优的化合物005A。通过HSCs体外培养浓度梯度实验我们确定了化合物005A的最佳作用浓度。我们对化合物005A处理后的细胞进行了HSCs表型分析,随后又对化合物005A处理后的细胞进行了体外短期、长期造血功能实验以及体内免疫缺陷鼠移植实验,以进一步验证化合物005A的造血扩增作用。我们还利用SPR实验以及CDK6酶活性实验检测化合物005A对p18蛋白的抑制作用。此外我们利用单细胞PCR技术对化合物005A引起的细胞内基因变化进行了分析,据此对可能的调控机制进行研究。结果：通过敲降人脐带血HSCs内的p18表达,我们发现流式细胞术检测所得HSCs比例明显增加,同时体外短期造血集落数量也明显升高,体外长期培养中的鹅卵石样原始造血区域频率也显著增加。当利用我们设计出的p18小分子抑制剂化合物对小鼠HSCs进行处理后发现,部分化合物可达到提高小鼠HSCs扩增的作用,其中化合物005A的EDso仅为5.2nM。随后将该系列化合物应用于人脐带血HSCs也发现了类似的作用,且化合物005A仍为效果最优化合物。为进一步优化化合物005A的造血扩增作用,我们采用了浓度梯度实验,从而确定20nM为其扩增人HSCs的最适浓度,其处理后可显著增加HSCs群体(CD34+CD49f+)的比例。化合物005A可达到体外短期造血集落以及体外长期培养中的鹅卵石样原始造血区域频率均显著增加的作用。造血功能检测的金标准——免疫缺陷鼠移植实验结果表明,化合物005A处理后细胞造血能力与未培养前基本相同,且其移植成功率明显升高。对化合物005A与p18蛋白的相互作用实验发现,005A可与p18蛋白结合,并可抑制其活性。单细胞PCR实验结果显示,化合物005A处理后Notch通路相关基因表达显著增加。结论：通过对p18的表达干扰实验发现,p18蛋白在人脐带血HSCs扩增调节中发挥了重要作用。因此我们认为p18是一个HSCs扩增的理想靶点。通过对p18小分子抑制剂体外造血扩增作用的研究发现,其可明显提高HSCs的数量,同时又可维持其造血能力水平。对其作用机制的研究发现,化合物005A主要激活了Notch信号通路的表达,其通路内相关基因表达均有不同程度的上调,进而发挥了促进HSCs扩增的作用。而化合物005A处理后,细胞周期进程并未显著增快,从而避免了发生干细胞耗竭,其对HSCs的扩增作用可能主要是通过增加干细胞对称性自我更新分裂来完成的。以上结果表明,我们发现了一个潜在的促HSCs扩增的小分子化合物,其有望对未来临床HSCs移植治疗发挥作用。