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弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫,能够感染所有有核细胞,可造成怀孕母畜或者孕妇流产、产畸形胎。其生活史复杂,具有多种感染方式,感染宿主广泛,感染阳性率高,对畜牧业发展可造成较为严重的损伤,同时也给人类健康带来了困扰,然而,目前仍没有研制出预防弓形虫感染的有效疫苗。参与蛋白质修饰和解除蛋白质修饰的分子一直是药物研制的重要靶标,作为具有解除蛋白磷酸化修饰功能的金属依赖性蛋白磷酸酶(PPMs)蛋白在动植物抗逆境胁迫过程中发挥着重要作用,弓形虫从速殖子转化为缓殖子的过程是弓形虫致病的生物学基础,也是弓形虫一种抗逆境胁迫形式,因此了解弓形虫蛋白磷酸酶PPMs是否参与此转换过程对研制弓形虫药物靶标具有重要意义,然而弓形虫磷酸酶PPMs在弓形虫生长发育过程中是否起重要作用目前还都不完全清楚。本研究以弓形虫蛋白磷酸酶PPM2A和PPM2B为研究对象,利用CRISPR/Cas9技术在RH△HX虫株中对PPM2A和PPM2B分别进行单基因敲除和双基因敲除,比较各基因敲除虫株和RH△HX虫株之间的生长发育差异以及毒力变化情况;同时,利用IFA技术,检测蛋白在弓形虫中的位置,利用酵母双杂交技术探究其是否与钙调蛋白(Calmodulin,简称Ca M)互作,并体外检测PPM2A蛋白的磷酸酶活性,以期阐述弓形虫蛋白磷酸酶PPM2A和PPM2B在弓形虫生长发育过程中的功能,为针对弓形虫蛋白磷酸酶靶标的药物研究或疫苗研究提供一定的筛选参考,具体实验内容如下:(1)PPM2A与PPM2B的定位实验利用CRISPR/Cas9技术,在RH△KU80虫株的目标基因下游近端进行基因打靶,然后将含有HA的定位标签同源重组到目的基因下游,通过间接免疫荧光实验,检测目标蛋白在弓形虫中的位置。染色结果显示,PPM2A弥散分布在整个弓形虫虫体中,PPM2B弥散分布在弓形虫胞质中。(2)PPM2A与PPM2B基因单缺失虫株和双缺失虫株的构建利用CRISPR/Cas9技术,在RH△HX虫株的目的基因中间进行打靶,然后将含有DHFR的药筛标签同源重组到目的基因的位置,通过乙胺嘧啶药物筛选、单克隆PCR鉴定等手段,最后成功获得RH△HX△PPM2A、RH△HX△PPM2B单克隆虫株;获得的RH△HX△PPM2A、RH△HX△PPM2B单克隆虫株进行相应的表型实验后发现,两种单克隆虫株在虫体生长、毒力等方面没有显著的差异,因此我们又对该两种蛋白进行双基因缺失实验。首先在RH△HX△PPM2A虫株的PPM2B基因序列中间进行打靶,然后将含有CAT的药筛标签同源重组到PPM2B基因的位置上,通过氯霉素药物筛选、PCR鉴定等手段,成功获得RH△HX△PPM2A△PPM2B单克隆虫株。(3)PPM2A和PPM2B敲除株的表型实验获得相应的单克隆虫株以后,将单克隆虫株分别进行复制实验、空斑实验以及毒力实验,复制实验采用让虫体在细胞爬片上正常培养24h后固定染色;空斑实验采用让虫体在六孔板正常培养7天后固定染色;毒力试验采用将虫体腹腔注射8-9周龄的雌性ICR小鼠,每只小鼠注射200个虫体,记录30天内小鼠存活状况。通过复制实验和空斑实验,我们观察到RH△HX△PPM2B以及RH△HX△PPM2A△PPM2B单克隆虫株的复制能力没有明显的减弱,RH△HX△PPM2A单克隆虫株的复制能力稍微减慢;通过毒力实验,我们发现RH△HX△PPM2A、RH△HX△PPM2B、RH△HX△PPM2A△PPM2B单克隆敲除虫株的毒力与RH△HX相比均没有明显减弱现象。(4)PPM2A体外酶活实验构建p E-SUMO-PPM2A质粒,将质粒转入大肠杆菌BL21中进行大量表达,然后体外纯化PPM2A蛋白,最后利用碧云天碱性磷酸酶检测试剂盒(P0321)进行PPM2A蛋白磷酸酶活性检测,当标准品或有碱性磷酸酶活性的孔呈现不同深浅的黄色后,通过在405nm测定吸光度来计算PPM2A的磷酸酶活性,但本研究未检测到PPM2A蛋白的磷酸酶活性。(5)PPM2A与Ca M酵母双杂交实验构建pGBKT7-PPM2A质粒与pGADT7-Ca M质粒,将pGBKT7-PPM2A质粒转入酵母菌Y2HGold感受态细胞内并涂布于SD/-Trp平板,将pGADT7-Ca M转化酵母菌Y187感受态细胞并涂布SD/-Leu平板,挑取两种平板上的单菌落置于同一离心管进行接合培养,然后取接合后的培养物涂布到DDO/X/A平板培养3-5天,我们发现DDO/X/平板上有蓝色菌落生长,并且验证pGBKT7-PPM2A质粒没有自激活现象,初步说明PPM2A和CaM存在相互作用。