伴随着青藏高原的抬升,喜马拉雅地区形成了极其复杂的地形结构和气候条件,该地区的植物受到广泛的关注.由于物种多样性丰富、特有现象明显和濒危程度严重,这一地区与相邻地区被列为全球生物多样性的热点之一.密叶红豆杉是西喜马拉雅地区特有的濒危物种,由于近年来森林采伐和其资源的过度采集,密叶红豆杉的野生资源正急剧下降,其保护形式已极为严峻.对濒危植物植物遗传变异和遗传分化的评估是研究物种进化潜能和存活机制以及制定有效保护策略的重要基础工作. 本文利用形态学和分子生物学数据对分布于西喜马拉雅地区的红豆杉的种级地位界定进行了研究.利用RAPD分子标记对巴基斯坦产的密叶红豆杉进行了保护遗传学研究,揭示了该种的遗传多样性水平和遗传结构及其影响因素,并提出了密叶红豆杉相应的保护策略.将RAPD数据和形态学性状比较分析,探讨了密叶红豆杉遗传分化与形态变异的关系.利用PCR-RFLP技术,对密叶红豆杉叶绿体基因开展了谱系地理分析,探讨其居群的进化历史和谱系地理关系.主要结果和结论如下: 1. 密叶红豆杉的种级界定红豆杉属植物的分类和名称使用在西喜马拉雅地区一直比较混乱,在巴基斯坦分布的红豆杉就被命名为三种不同的种类,即:须弥红豆杉(Taxuswallichiana Zucc.)、欧洲红豆杉(T. baccata L.)和密叶红豆杉(T.fuana NanLi&R.R.Mill),该地区红豆杉的种级地位存在较大的争议.我们对须弥红豆杉、欧洲红豆杉和初步鉴定为密叶红豆杉的62份蜡叶标本的27个形态学性状进行了主成份分析,从标本分布的散状图可以看出,不同种的标本各自形成明显不同的群集(cluster),种间没有交叉.组合的形态性状可做为区分三个不同种可靠的鉴别特征.基于核基因组的ITS序列和叶绿体基因组的trnL-F序列的简约性分析,强烈支持三个种形成不同的分支.分布于西喜马拉雅地区的红豆杉为密叶红豆杉,而不是欧洲红豆杉或须弥红豆杉,密叶红豆杉的种级地位得到形态学和分子证据的强烈支持,是一个"好种".欧洲红豆杉、须弥红豆杉和密叶红豆杉具有各自的分布区.欧洲红豆杉广布于欧洲,非洲北部和西亚,经土耳其向东达伊朗北部；密叶红豆杉主要分布于西喜马拉雅地区,从阿富汗东部、巴基斯坦北部沿喜马拉雅山向东达印度西北部、尼泊尔中部和中国西藏的西南部,在尼泊尔中部与须弥红豆杉重叠分布；而须弥红豆杉则主要分布于东喜马拉雅和中国南部地区. 2. 保护遗传学利用 RAPD 分子标记对密叶红豆杉采自巴基斯坦的 10 个自然居群进行保护遗传学研究.在 32 条 RAPD 通用引物中筛选出 16 条重复性好,条带清淅的引物.用这 16 条引物共扩增出 193 条 RAPD 带,其中 164 条为多态带,占84.97﹪.结果表明密叶红豆杉居群内的遗传多样性较低,不同居群的多态位点比率 (PPB) 为 29.53﹪-50.26﹪,平均为 38.34﹪；Nei 的遗传多样性指数(H<,E>) 为0.1165,Shannon 多样性指数 (S) 0.179.居群间存在较高的遗传变异,遗传分化系数( G<,ST>) 为 0.5842,与 AMOVA 分析所得结果相近 (Φ<,ST>=0.5685).在巴基斯坦的 10 个野生居群中,居群内低的的遗传多样性和居群间高的遗传分化可能是由于密叶红豆杉的生境的片断化和进化历史,如遗传漂变和有限的基因流所导致.该结果可以说是非常"意外"的,因为密叶红豆杉为异交、风媒传粉和长寿命的木本植物.在此结果的基础上对密叶红豆杉的就地保护和迁地保护的策略进行了讨论. 3.RAPD数据与形态学性状间的分化利用DPS和PCA对密叶红豆杉的形态学性状进行了分析,基于7个数量性状分析,居群间的平均欧式距离为 1.2889 到 6.7115,结果表明这些性状受生态因子的影响较大.Mantel 检测显示居群间的遗传距离与地理距离之间没有显著相关性,而欧式距离与地理距离间存在某种程度的相关性.居群间的遗传距离与欧式距离间不存在正相关.RAPD数据与形态学性状间的分化可能受密叶红豆杉长期的进化历史、遗传漂变、居群大小的下降及生境坏片断化因素等影响.表型的变异比遗传变异更容易受人为活动的影响. 4.谱系地理学利用 10 个限制性内切酶对叶绿体的 13 个基因片段进行了 PCR-RFLP 检测,最终仅在 trnL-F 片段中发现了一个多态位点.密叶红豆杉的叶绿体存在较低水平的遗传变异,单倍型的多样性指数为0.03-0.13,总的多样性指数仅为0.009.遗传多样性水平也非常低,除居群SW的遗传多样性为0.09外,其余居群的遗传多样性均为0.在10个居群中发现2个单倍型,其中单倍型1分布最广,存在于所有的居群中,而单倍型II仅发现于SW居群中的单一个体中.很明显单倍型II可能是由单倍型I演化而来,两个单倍型间有2个碱基的差异. 在本研究中,由于检测到的单倍型有限,密叶红豆杉的谱系地理关系没有得到很好的解决,还需要进一步的深入研究.密叶红豆杉比其它裸子植物具有更低的叶绿体基因变异,可能与其本身的进化历史及PCR-RFLP技术本身的限制有关.