端粒酶在恶性肿瘤、心血管疾病的发生发展中扮演重要的角色，深入理解它们之间的关系，及端粒酶在这些病理过程中作用的具体机制，必将给肿瘤及心血管疾病的治疗带来巨大的变化。hTERT介导的细胞转化、增殖是近年来端粒酶研究的热点。 hTERT是端粒酶全酶的蛋白组分，在端粒延伸中以逆转录酶活性催化合成端粒重复序列，在正常组织不表达，在肿瘤组织及某些活跃增殖的细胞高表达。传统观点认为端粒酶通过维持端粒的长度而参与细胞衰老和永生化生物学过程的调节，近年来的研究揭示，在正常细胞过表达hTERT能促使细胞增殖和转化，这种作用与端粒延伸无关，甚至不需要端粒酶RNA亚基的参与，提出hTERT可能具有其它的非端粒延伸的功能。 通过近年来的研究，hTERT的促细胞增殖作用已经明确，但其中的机制尚未阐明；另一方面，若在肿瘤细胞沉默该基因，是否会出现有利于肿瘤治疗的效应?本研究的目的在于探讨hTERT的沉默对肿瘤细胞增殖的影响及可能机制。具体地说，用RNAi技术沉默HeLa细胞hTERT的表达，以观察在肿瘤细胞这种多个癌基因、抑癌基因突变，多条信号通路和代谢特征改变的背景下，单纯下调hTERT的表达，能否使细胞的生长速度明显放慢，使肿瘤细胞的基因表达谱发生显著改变，能否增加细胞对某些化疗药的敏感性，探讨端粒酶催化亚单位hTERT促细胞增殖作用的机制，及是否适合作为肿瘤治疗的靶点。 第一部分 shRNA表达体的构建和沉默细胞株的筛选方法： 1．以HeLa细胞提取的基因组DNA为模板经PCR得到U6启动子； 2．在质粒pUC119的MCS内插入U6启动子成为RNAi载体； 3．在RNAi载体U6启动子的下游插入干扰序列获得shRNA-hTERT表达体； 4．将两个shRNA-hTERT表达体和RNAi载体分别与pEGFP-C1共转染HeLa细胞，G418筛选。 结果： 1．测序显示构建RNAi载体和表达体正确； 2．筛选得到两个hTERT沉默的HeLa细胞株和一个对照细胞株。 第二部分 hTERT的沉默对HeLa细胞生长及化疗敏感性的影响方法： 1．RT-PCR和Western-Blot检测hTERT和c-myc的表达水平； 2．细胞计数法绘制细胞生长曲线； 3．倒置显微镜下观察长春新碱、紫杉醇、顺铂等化疗药对干扰组和对照组细胞的影响，流式测细胞死亡率； 4．细胞免疫化学显示微管组织状态在各组细胞有无差别。探讨各组细胞对长春新碱和紫杉醇敏感性差别的原因，hTERT可能具有的新的功能是否与微管组织的调节有关。 结果： 1．干扰的靶基因hTERT被完全沉默； 2． c-myc的表达在干扰组和对照组细胞无显著差异； 3．筛选得到的第六代干扰组和对照组细胞生长速度无显著差异； 4．紫杉醇处理的干扰组细胞死亡率高于对照组； 5．干扰组和对照组细胞经紫杉醇处理后的微管分布没有发现显著差异。 结论： 1．成功构建了一个RNAi载体及两个shRNA表达体。 2．成功建立了两个hTERT沉默的细胞株。 3．发现在HeLa细胞单独下调hTERT的表达，不能使c-myc表达明显改变，不能有效降低肿瘤细胞的生长速度，却可以增加细胞对紫杉醇的敏感性。 4．hTERT与紫杉醇对细胞毒性协同效应的原因，及hTERT是否参与微管的调节有待进一步探讨。