研究目的建立一种新的单倍体造血干细胞移植模式,即H-2半相合小鼠双供体外周血造血干细胞移植模型。该新的移植模式可达到造血重建、供体长期完全稳定植入、GVHD程度轻、避免细菌、真菌及病毒等严重感染并发症、死亡率低的目的。研究内容1、依据文献报道及本实验室成熟的实验方法,建立小鼠H-2半相合经典清髓性外周血造血干细胞移植模型,并鉴定该模型;2、在本实验室既往已经建立的实验动物模型的基础上,降低预处理强度,采用TBI2Gy预处理方案,输注等量的两种单倍体相合、单倍体相合联合完全不相合的供鼠G-CSF动员的外周血造血干细胞,并加大输注的细胞总量,建立H-2半相合小鼠双供体外周血造血干细胞移植模型,观察该模型的安全性和可行性,并与经典移植组相对照,比较造血重建规律、供体植入特点、GVHD发生率和GVHD致死率、生存率等情况;3、在此基础上,尝试在无预处理条件下,建立H-2半相合小鼠双供体外周血造血干细胞移植模型,并检测受鼠移植后各组织器官各细胞亚群中的供体植入率,以及外周血淋巴细胞亚群的变化等。研究方法经典清髓移植组:供鼠选择雄性C57,从移植前5天开始供鼠每天接受rh G-CSF(100μg/kg)的动员,皮下注射,间隔12h,2次/日,共5天之后提取脾单个核细胞(sp MNC)。受鼠选择雌性CB6F1(雌性BALB/c和雄性C57的杂交一代),以8Gy TBI为预处理方案,TBI使用60Coγ射线,钴源距离为76cm,剂量率1.03Gy/min,受鼠经TBI照射2h之内回输经G-CSF动员的供体脾单个核细胞(sp MNC),细胞输注总量是3×107。移植后从小鼠一般状况、造血恢复、供体植入、GVHD发生情况、死亡情况、脏器病理等方面鉴定该模型;双供体移植组:受鼠也选择CB6F1,降低预处理强度至TBI 2Gy(较经典移植降低了4倍),TBI使用60Coγ射线,钴源距离为76cm,剂量率1.03Gy/min,受鼠经TBI照射2h之内回输经G-CSF动员的两种供体来源的sp MNC共12×107(各6×107),移植物总细胞量是经典移植组的4倍。在保证雄性C57做半相合供者不变的前提下,为探讨另一个半相合供者BALB/c的性别以及第三方同种异基因全不相合供者C3H对植入的影响,我们将双供体移植组分为三组:A组=雄性C57+雌性BALB/c,B组=雄性C57+雄性BALB/c,C组=雄性C57+雄性C3H。观察双供体移植各组的造血重建、供体植入、GVHD发生情况及生存情况等。与经典移植组对比,证实双供体移植模型的可行性和安全性,并优化新的双供体单倍体移植模型;在此基础上,尝试在无预处理条件下,建立H-2半相合小鼠双供体移植模型,观察小鼠一般状况、造血、植入、GVHD、死亡、脏器病理等情况,并检测受鼠移植后各组织器官和各亚群中的供体嵌合率等。研究结果首先,本实验成功建立了小鼠H-2半相合清髓性外周血造血干细胞经典移植模型。其次,在上述实验动物模型的基础上,降低预处理强度(TBI由8Gy降低到2Gy),通过输注双供体造血干细胞,加大移植物细胞总量(由3×107增加到12×107),不使用免疫抑制剂,不做GVHD预防,成功建立了小鼠H-2半相合双供体外周血造血干细胞移植模型。具体而言,经典移植组和双供体移植各组的而对比结果有:(1)经典移植组出现严重造血抑制,WBC<1×109/L持续3-5d;A、B、C各组未出现造血抑制(WBC(29)3×109/L);(2)经典移植组快速植入,1w达到外周血完全植入;A、B、C各组1w混合植入,2w达完全植入。(3)经典移植组移植后34天GVHD发生率及GVHD致死率均为100%。双供体移植组:34天总体GVHD发生率及致死率分别是49.6%、50%(P<0.01,P<0.05),50天分别60.4%和81.2%,50天总体存活率50.9%。(4)双供体移植组中,两种供者在受鼠体内的供体植入率有差别。双供体移植A组和B组中,C57雄性供者在植入上占优势,2w之内受鼠体内可检测到少量雌性BALB/c供体成分,2w之后受鼠体内C57供者完全植入。而C组受鼠在早期(4d)时检测供体植入率即无C3H供体成分,2w时也可达到C57供者完全植入。(5)双供体移植A、B、C各组的造血恢复、供体植入率、GVHD发生率均无差异,B和C组GVHD致死率略少于A组,但无统计学意义(P>0.05,P>0.05);B组OS略优于C组及A组,但无统计学意义(P>0.05,P>0.05)。无预处理条件下,也成功建立了H-2半相合小鼠双供体外周血造血干细胞移植模型,受鼠外周血细胞三系缓慢降低,但可自行恢复,完全未发生造血抑制。外周血细胞亚群(除外CD8+、CD11b+细胞)短暂受抑制,但可逐渐恢复正常。不做GVHD预防,却未见临床GVHD发生,组织脏器病理切片显示双供体组脏器损伤程度明显轻于经典移植组。受鼠外周血、各组织器官、各细胞亚群移植后均经过1m时间的混合嵌合才转化为完全嵌合,且无预处理条件下,双供体移植组小鼠移植后获得的供体嵌合体为多系嵌合体。研究结论预处理强度和免疫抑制剂不再是供体植入的必备条件。(1)以2Gy的TBI为预处理方案,较经典移植预处理强度(TBI 8Gy)降低了4倍,输注等量的两种半相合供鼠细胞,细胞总量是经典移植细胞量的4倍,移植后不使用免疫抑制剂,无GVHD防治措施,结果移植后无明显抑制、造血重建快、植入稳定、GVHD明显减轻、长期存活明显增加,成功建立了H-2半相合小鼠双供体外周血造血干细胞移植模型,与临床双份脐血移植类似,双供体移植模型最终只有优势供体植入;(2)在无预处理条件下,成功建立了小鼠H-2半相合双供体外周血造血干细胞移植模型:受鼠造血细胞及外周淋巴细胞亚群短暂抑制但可逐渐恢复正常、完全避开造血抑制、虽然不做GVHD预防却未见临床GVHD发生、织脏器病理切片显示双供体组脏器损伤程度明显轻于经典移植组,外周血、各组织器官、各细胞亚群均经过1m时间的混合嵌合,最终转化为完全嵌合,且为多系嵌合体。本研究为临床开展HLA半相合双供体造血干细胞移植提供动物实验依据。