胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居全世界恶性肿瘤第四位，死亡率居癌症死因第二位，在我国其发病率居各类肿瘤的首位，每年约有17万人死于胃癌。胃癌的发病原因尚不明确，可能与多种因素，如生活习惯、饮食种类、环境因素、遗传素质等有关，也与慢性胃炎、胃息肉以及长期幽门螺杆菌(HP)感染等有一定的关系，而这些因素最终导致胃癌的机制尚不明确。因此，探索胃癌发生发展的分子机制对于胃癌的治疗具有重要意义。　　 目前普遍认为肿瘤的发生发展与多种肿瘤抑制基因和肿瘤相关基因的失活有关。DNA异常甲基化是除缺失与突变外导致肿瘤抑制基因失活的第三种机制。DNA甲基化是具有可逆性与遗传性的一种基因修饰方式，是指DNA双螺旋中，胞嘧啶核苷酸的嘧啶环第5位碳原子在DNA甲基转移酶介导下以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体而发生甲基化。　　 NDRG1(N-myc downstream regulated gene1)，是1997年在结肠癌细胞株中首先发现的一种与细胞分化相关的基因，定位于人染色体8q24.3，其5端包含一个CpG岛，主要存在于细胞质和细胞膜。NDRG1基因产物在多数组织中均有表达，主要参与细胞的生长发育及分化成熟，并与肿瘤的转移密切相关。但该基因与肿瘤转移的相关性尚存在很大争议，主要有2种观点，一种认为NDRG1可以抑制肿瘤的转移，另一种则认为NDRG1促进肿瘤的转移。对于NDRG1与胃癌的关系，目前国内外尚缺乏报道，但国内已有研究显示NDRG1在胃癌组织中较癌旁相对正常组织表达减少，为胃癌的一种候选的肿瘤转移抑制基因。　　 目的：　　 本研究旨在探讨NDRG1在胃癌中的表达情况、可能的分子调节机制以及与胃癌发生发展、转移及与临床病理学特征的关系，为临床治疗提供新的思路及依据。研究的第一部分我们在细胞和组织水平上检测NDRG1的表达水平，分析其与临床病理学特征的关系;第二部分，通过体外构建NDRG1过表达或表达沉默胃癌细胞株，观察对其增殖和侵袭能力的影响;第三部分我们通过检测NDRG1的基因变异和启动子区CpG岛甲基化状态分析其表达下调相关机制及与临床病理学特征的关系。进一步通过体外实验研究胃癌细胞株在去甲基化制剂的作用下NDRG1表达是否可以逆转，由此探讨NDRG1与5-Aza-dC药物调控的意义及治疗胃癌的潜在临床应用价值。　　 方法：　　 一、实验对象　　 2009年4月～2010年6月中国医科大学肿瘤研究所行根治性手术治疗的胃癌患者癌和癌旁配对组织共112例;人胃癌细胞株SGC7901、MGC803、MKN45、BGC823、AGS、HGC27和永生化正常人胃细胞株GES1。　　 二、实验方法　　 1、细胞培养:GES1、SGC7901、MGC803、MKN45、BGC823、AGS和HGC27按常规培养。　　 2、qRT-PCR检测NDRG1基因mRNA在细胞和组织水平的表达。　　 3、Western blot检测7株细胞及胃癌旁和癌组织中NDRG1蛋白表达含量。　　 4、免疫组织化学检测胃癌旁和癌组织中NDRG1蛋白表达水平。　　 5、阿尔玛蓝检测转染致NDRG1过表达或沉默后胃癌细胞的活力。　　 6、Transwell侵袭实验检测转染致NDRG1过表达或沉默后胃癌细胞侵袭的能力变化。　　 7、遗传学层面，HRM检测NDRG1的基因突变状况;表遗传学层面，MSP法检测NDRG1基因DNA启动子甲基化状况。　　 8、去甲基化制剂5-Aza-dC处理DRG1表达下调的胃癌细胞株，细胞分化诱导剂TPA处理低分化胃癌细胞株，检测细胞分化诱导前后NDRG1表达变化。　　 结果：　　 第一部分胃癌细胞及组织中NDRG1表达及临床意义研究　　 1、qRT-PCR结果显示，NDRG1在6株胃癌细胞中的表达水平均低于胃正常粘膜上皮细胞GES1，且在中分化胃癌细胞株SGC7901的表达较高于其他低分化或未分化的胃癌细胞株。49例胃癌组织NDRG1mRNA（3.15±1.77）表达水平明显低于相应癌旁组织(5.56±2.63)，差异显著（P＜0．01）。　　 2、Western blot结果显示NDRG1在GES1中表达最高，SGC7901次之，AGS和HGC27中表达最低。20例组织的Western blot结果证实NDRG1在胃癌组织中表达下调。免疫组化结果显示NDRG1主要在正常胃粘膜细胞和分化较好的胃癌细胞的细胞浆内表达。NDRG1蛋白在112例胃癌旁相对正常组织的82例中呈高表达，而对应的癌组织中仅有20例呈NDRG1高表达，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。　　 3、胃癌组织NDRG1蛋白表达水平与组织分化程度(P＜0.05)、浸润深度(P＜0.05)和淋巴结转移情况(P＜0.01)密切相关;而与年龄、性别、肿瘤大小，部位、临床病理分期等临床病理资料无明显关联(P＞0.05)。　　 4、选择低分化的胃癌细胞株HGC27，采用分化诱导剂TPA处理72 h后，NDRG1的表达明显上调，且随药物浓度呈正相关。　　 第二部分NDRG1表达对胃癌细胞侵袭转移能力的实验研究　　 1、筛选NDRG1低表达的胃癌细胞株AGS，真核表达质粒pcDNA3.1-NDRG1转染48h后，Alamar Blue细胞活力实验显示NDRG1过表达抑制AGS细胞的增殖，Transwell实验结果显示AGS细胞的侵袭能力下降。　　 2、筛选NDRG1高表达的胃癌细胞株SGC7901，采用NDRG1特异干扰质粒沉默其表达后，胃癌细胞株SGC7901的增殖力、侵袭力均明显增强。　　 第三部分胃癌细胞及组织中NDRG1表达下调机制的实验研究　　 1、高分辨率溶解曲线(HRM)检测胃癌细胞系中NDRG1基因16个外显子的基因变异状况，结果显示16个外显子未发现明确的基因突变。　　 2、甲基化特异性PCR(MSP)检测7株胃细胞株中NDRG1基因启动子甲基化情况，HGC27和AGS显示其启动子区甲基化;BGC823、MGC803、SGC7901及MKN45为部分甲基化，而GES1则显示非甲基化。　　 3.52例胃组织中，癌组织的甲基化率为61.5％，而癌旁相对正常组织中则为15.4％，差异具有统计学意义(P＜0.05)，胃癌DNA甲基化与TNM分期及淋巴结转移相关，未发现与其他临床病理学特征的关系。　　 4、对NDRG1低表达的胃癌细胞株HGC27采用DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-dC和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理72 h，结果显示单用5-Aza-dC作用后NDRG1表达水平明显升高(P＞0.05)，而TSA作用后NDRG1的表达变化不明显。5-Aza-dC和TSA联合处理组NDRG1的表达稍高于单用5-Aza-dC作用组中NDRG1的表达水平。HGC27细胞株在去甲基化制剂作用后mRNA和蛋白水平明显增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　 结论：　　 1、NDRG1在胃癌细胞及组织中表达下调，且与胃癌分化程度、浸润深度及胃癌淋巴结转移密切相关。　　 2、NDRG1表达可以抑制胃癌细胞的增殖，降低其侵袭转移的能力。　　 3、HRM结果提示NDRG1在胃癌中的表达下调可能与基因突变无明显相关。　　 4、NDRG1启动子区CpG岛的异常甲基化可能是胃癌细胞及组织中NDRG1表达水平下调的主要机制之一。　　 5、分化诱导剂TPA和去甲基化制剂5-Aza-dC可以逆转胃癌细胞中NDRG1的表达下调。