第一章远隔缺血时处理对心脏瓣膜置换术多器官保护的研究　　研究目的：　　体外循环心内直视手术后多器官的损伤一直是影响心脏外科患者术后疗效和远期生存预后的重要因素。如何减轻器官损伤一直是心脏外科的重要课题。心脏瓣膜疾病是后天性心脏病发病率较高的一类疾病，其中风湿性心脏病在我国是导致心脏瓣膜病变的主要病因，绝大多数风湿性心脏病患者术前均有不同程度的心肺肝肾等器官功能受损，体外循环手术创伤则进一步加重患者术后各器官功能损害。我们先前的研究表明远隔肢体缺血时处理可减少心脏瓣膜置换手术心肌cTnⅠ的释放。本研究在前期研究的基础上，进一步通过较大样本量的研究，评价远隔缺血时处理能否减轻心脏瓣膜置换术后患者心肺肾肝重要器官的损伤，发挥器官保护作用。　　研究方法：　　201例心脏瓣膜病在我院择期行心脏瓣膜置换术患者随机分为两组:对照组(CON.)100例，术中止血带包缚于右下肢近心端，不充气。远隔缺血时处理组（RIPerC.）101例，在阻断主动脉后立刻给予下肢止血带充气加压至600 mmHg维持5min，再完全放气持续5min此为一个周期，重复三个周期。所有患者均由相同手术组医师实施手术，麻醉医生，术者，体外循环灌注师、术后医护人员及检验人员未告知研究的分组情况。术后给予常规治疗和监护。　　分别记录患者性别、年龄、体重、术前NYHA分级、术前房颤情况、术前EF值、手术方式、主动脉阻断时间、CPB时间、手术时间、术中心脏复跳情况、术后机械通气时间、术后正性肌力药物使用情况、术后24小时引流量、24小时尿量、ICU时间以及术后住院时间等临床指标进行统计分析。　　于术前、开放主动脉后12h、24h和48h抽取患者静脉血分别测定:①血清cTnⅠ和CK-MB浓度;②BUN，肌酐，肌酐清除率，血清胱抑素C(CysC)，β微球蛋白等肾功能指标，③总胆红素(TBIL)，谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，血清白蛋白等肝功能指标;④血清C反应蛋白(CRP)浓度。术后连续血气分析，并记录术后0小时、1小时、3小时、6小时、12小时的氧合指数以及乳酸值。根据急性肾损伤诊断标准评价患者是否存在急性肾损伤。根据急性肺损伤诊断标准评价患者是否存在急性肺损伤。　　数据分析采用SPSS17.0统计软件。组间比较:使用X2检验分析计数资料;采用方差分析重复测量计量资料;采用单向方差分析非重复测量的计量资料。p＜0.05认为差异具有显著性。　　研究结果：　　两组患者在年龄、性别、体重、术前心功能分级、EF值、手术方式，手术时间，体外循环时间，主动脉阻断时间没有显著性差异，具有可比性。两组患者术后机械通气时间、ICU时间及住院时间无统计学差异。远隔缺血时处理组术后引流明显少于对照组（458.26±264.27ml VS545.10±349.00ml，P=0.048）;远隔缺血时处理组正性肌力药物评分低于对照组(96.45±73.79 VS121.56±89.61，P=0.032)。　　远隔缺血时处理组术后48小时内血浆cTnⅠ的浓度曲线下面积(AUC)值较对照组明显下降，有显著性差异（128.68±102.56 vs172.33±184.38; P=0.04）。术后48小时，远隔缺血时处理组患者的总胆红素明显低于对照组，有显著性差异（18.64±9.77μmol/L vs22.23±12.97μmol/L;P=0.028）。两组患者术后各时间点的乳酸值无明显差异，术后6小时远隔缺血时处理组患者的动脉血氧合指数明显高于对照组，有显著性差异(196.7±53.8 mmHg vs178.6±55.5mmHg，P=0.02)。远隔缺血时处理组患者术后急性肺损伤的发生率较对照组的明显降低(36.6％ VS51％，P=0.040)具有显著性差异。术后48小时，缺血时处理组患者血浆CysC值明显低于对照组，有显著性差异（0.91±0.31mg/L vs1.02±0.48mg/L，P=0.049），远隔缺血时处理组术后48h血清肌酐值显著低于对照组（86.28±18.49μmol/Lvs111.38±39.29μmol/L，P=0.000），但急性肾损伤发生率两组无显著差别。两组患者术后各时间点的CRP浓度组间无明显差别。　　研究结论：　　远隔缺血时处理可以减少心脏瓣膜置换术后患者正性肌力药物用量，减少术后cTnⅠ的释放，提示远隔缺血时处理能够减轻体外循环术后心肌缺血再灌注损伤，有一定心肌保护效果。同时远隔缺血时处理亦能对心脏以外的其他重要器官（肺脏、肝脏、肾脏）产生一定程度的保护作用。　　创新点:　　1首次在国内外进行远隔缺血时处理较大样本量的临床研究，进一步证实了我们先前的小样本量的研究结果，远隔缺血时处理可以减轻成人瓣膜置换术后心肌缺血再灌注损伤。　　2本实验首次对远隔缺血时处理心脏以外的器官保护进行了临床研究。证明远隔缺血时处理对肺脏、肝脏和肾脏损伤有一定程度的保护作用。　　第2章远隔缺血时处理对心脏瓣膜置换术心肌微小RNA表达和心肌细胞凋亡的作用　　研究目的：　　本实验旨在观察远隔缺血时处理对风湿性心脏瓣膜病患者瓣膜置换术心肌微小RNA(miRNAs)表达的影响和对心肌细胞凋亡的作用，从微小RNA的角度探讨远隔缺血时处理对心肌缺血-再灌损伤保护的可能机制。　　研究方法：　　30例风湿性心脏瓣膜病择期行双瓣膜置换术患者，随机分为两组:对照组(CON.)15例;远隔缺血时处理组(remote ischemicperconditioning，RIPerC.)15例。止血带包缚于右下肢近心端，对照组不充气，处理组在阻断主动脉后立即将止血带加压充气，其压力为600 mmHg并且持续5min，然后完全放气完全松弛5min，改为一个周期，共行三个周期。将患者的一般资料、术前的心功能、术后机械通气的时间、术后引流量、术后重症监护的时间、术后使用正性肌力药物的用量、术后严重的并发症和总的住院时间作为观察指标。术后随访病人30天。　　分别于主动脉阻断前、开放主动脉阻断钳后5分钟，剪取少许右心耳组织，采用miRNA微阵列芯片法检测其差异表达;RT-PCR法进一步验证4种心肌miRNAs表达，RT-PCR法检测BCL2,BAX和PDCD4的mRNA表达，Westen Blot法检测BCL2，BAX和PDCD4凋亡蛋白表达。TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况。　　统计学处理:使用SPSS17.0软件统计分析数据。组间比较:非正态分布的数据采用Mann-Whitney秩和检验;计数资料采用X2检验;不同时间点的miRNAs，mRNA以及蛋白表达情况采用t检验。认为p＜0.05有显著性差异，具有统计学意义。　　研究结果：　　两组病例术前的一般资料、手术的方式、手术的时间、主动脉阻断的时间以及体外循环的时间没有统计学意义，有可比性。所有病例均顺利康复，无并发症及死亡。心肌组织miRNAs微阵列检测显示，体外循环术后有17个miRNA表达变化，其中13个miRNA显著上调(miR-1，miR-17，miR-19b，miR-20a，miR-33a，miR-130a，miR-140-5p, miR-195, miR-301a, miR-324-5p, miR-377, miR-491-5pand miR-657),4个miRNA下调(miR-21,miR-24,miR-1275 andmiR-1973)，缺血时处理组心肌缺血再灌注后miRNAs表达与对照组miRNAs表达谱比较显示，缺血时处理组miR-1，miR-17，miR-20a，，miR-130a，miR-140-5p，miR-195表达下调，而miR-21，miR-24，miR-1275表达上调。而miR-19b，miR-33a，miR-301a，miR-324-5p，miR-377，miR-491-5p，miR-657 and miR-1973的表达两组则无显著差别。　　RT-PCR对miR-1，miR-21，miR-24和miR-195进行定量检测结果显示，与对照组比较，RIPerC组的miR-1和miR-195的表达均显著下调(P＜0.05)该结果与miRNAs微阵列检测结果一致，但是RIPerC组的miR-24和miR-21的表达情况与对照组无统计学意义上的差别。　　RT-PCR对心肌Bcl-2、BAX和PDCD4的mRNA表达，实验组心肌BCL2 mRNA表达较对照组显著上调(2.4倍，P＜0.05)， BAX，PDCD4 mRNA表达无明显变化。　　Western Blot检测心肌Bcl-2、BAX和PDCD4蛋白表达。实验组的BCL2(1.3倍，P＜0.05)蛋白表达与对照组比较显著增加，而BAX蛋白表达明显减少(0.5倍，P＜0.05)。　　TUNEL法检测两组患者心肌细胞凋亡情况，结果显示实验组心肌凋亡细胞数较对照组明显减少。　　研究结论：　　下肢远隔缺血时处理可以调控体外循环心脏瓣膜置换术患者心肌MicroRNAs的表达，使miRNA-1和miRNAs-195表达下调。下肢远隔缺血时处理减轻心肌细胞凋亡，增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达和减少促凋亡蛋白BAX表达。远隔缺血时处理可能通过对心肌相关miRNAs的调控，抑制心肌细胞凋亡。确切结论有待进一步研究。　　创新点：　　1.本研究首次研究了远隔缺血时处理心脏瓣膜置换停跳体外循环手术的心肌miRNAs表达的影响。　　2.本研究首次探讨了远隔缺血时处理对心脏停跳体外循环手术的人心肌凋亡基因和蛋白表达的影响。　　不足与展望　　1.本部分研究病例数尚有限，组间条件亦难以完全均衡，可能影响结果评价。　　2.不同的缺血处理模式可能对研究结果有不同的影响，由于客观条件限制，未能进行多种缺血处理的对比研究。　　3.本研究未对缺血时处理后心肌miRNAs表达变化与凋亡基因之间关系进行深入研究，因此未能明确两者之间的相关性。但我们的研究结果也为后续研究提供了新的研究方向和思路。