脊椎动物中免疫系统主要由天然免疫与适应性免疫两部分组成。鱼类作为最低等的脊椎动物，虽然在进化中获得了适应性免疫，由于鱼类的适应性免疫的产生受到多种因素的影响。在抵抗外界病原入侵的过程中，鱼类的天然免疫系统仍然具有至关重要的作用。本研究以赤点石斑鱼与大黄鱼为研究对象，对赤点石斑鱼的天然免疫因子凝集素、MHCIIB与ICLP，大黄鱼的识别因子肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein，PGRP)与巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage Migration Inhibitory Factor，MIF)进行了初步研究。报告内容如下： 1.凝集素(lectin)在脊椎动物与无脊椎动物中是天然免疫系统关键的组成部分，能够特异识别清除病原菌。本研究基于赤点石斑鱼的EST序列设计特异引物，通过RACE的方法得到该基因全长cDNA序列，将其命名为EALecl。其中cDNA序列全长为827bp，5-UTR为28bp，3-UTR为151bp，具有明显的加尾信号AATAAA。开放阅读框648bp，编码215个氨基酸，其中信号肽长度为31个氨基酸。氨基酸分析表明，该序列在N端有丰富的半胱氨酸残基、胶原区特点的G-X-Y重复序列、颈区及C-末端具有糖识别位点，属于C型胶原凝集素；其CRD区域的糖识别关键氨基酸为EPD，可能是甘露糖型凝集素向半乳糖型凝集素分化的一个过度类型。 2.RT-PCR以及real-timePCR检测结果表明在赤点石斑鱼的12个不同组织中均有不同程度的表达。RT-PCRSSCP结果表明在赤点石斑鱼的12个组织中，获得4种表达类型的Lectin，利用PCR获得了lectinDNA序列，与cDNA相比较，EALec具有4个内含子，5个外显子。将EALec-1克隆到pET28(A)转化BL21表达菌中，获得26Kd大小的蛋白表达片段，体外试验表明，该蛋白对革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌均具有凝集作用，糖特异性结合试验表明，该蛋白为甘露糖型凝集素。 3.本研究克隆获得赤点石斑鱼非特异性免疫因子MHCIIB基因的4个cDNA全序列，序列全长为1195-1355bp，含有3’UTR、启动子、多肽结合区(β1)、IGC区(β2)、跨膜区、胞质区和5‘UTR区，编码区大小为750bp。RT-PCR与SSCP技术研究了赤点石斑鱼MHCIIB的表达多态性，发现其在头肾、心、肝等12个组织器官中均能有效表达，表达多态性也异常丰富。 4.MHCclassII恒定链(invariantchain-likeproteinsICLP)与免疫反应密切相关，其参与对抗原的处理，保证多肽不被进一步降解为氨基酸。通过RACE反应获得赤点石斑鱼ICLP2cDNA全序列，全长1837bp，包括44bp的5’UTR区，861bp的开放阅读框以及932bp的3’UTR区，编码286个氨基酸。对赤点石斑鱼10个组织的ICLP2基因进行PCR扩增和测序，结果表明赤点石斑鱼ICLP2基因的表达不存在组织特异性。此外，氨基酸序列同源比对的结果表明，赤点石斑鱼与其它16种脊椎动物ICLP2的相似度在25～78％之间，与狼鲈和鳜鱼ICLP2因子的同源程度最高，分别为78％和74％。 5.肽聚糖识别蛋白II(pglyrp2)是一类具酰胺酶的模式识别受体，通过RACE技术克隆了大黄鱼的pglyrp2基因，cDNA全长1831bp，带有一个1449bp的开放阅读框，编码带有一个21个氨基酸信号肽的482个氨基酸的pglyrp2蛋白。RT-PCR和荧光定量PCR分析表明，大黄鱼pglyrp2基因在肝脏强烈表达，在性腺、肠、胃中弱表达；大黄鱼的pglyrp2还在未受精卵中高度表达，在胚胎发育和卵黄囊仔鱼阶段低量表达。通过人工感染模型发现，大黄鱼的pglyrp2还是一种组成型兼诱导型的急性时相蛋白，它的诱导伴随着宿主抗氧化免疫防御反应的激活。通过原核表达载体PET28a表达并纯化了大黄鱼pglyrp2的重组蛋白。 6.本文采用同源克隆的方法从大黄鱼肝脏中克隆了大黄鱼MIF的同源基因。大黄鱼MIF的cDNA全长634bp，编码一个长115aa的蛋白质，其基因结构非常保守，具有3个外显子和2个内含子。RT-PCR与荧光定量PCR研究表明：大黄鱼MIF基因在所选的11个组织中都有表达，其中在脑和肝中表达量较高。将哈维氏弧菌(Vibroharveyi)人工攻毒后的大黄鱼作为研究炎症反应的材料，发现大黄鱼MIF在攻毒后大黄鱼的肝脏、性腺和头肾中的mRNA表达量显著升高。首次表明鱼类MIF可能参与了炎症反应的发生发展。利用原核表达载体PET28a，体外表达和纯化了大黄鱼MIF融合蛋白。生物活性分析首次表明鱼类MIF融合蛋白具有硫醇蛋白氧化还原酶的活性和激活巨噬细胞释放NO的功能。