异体滑膜间充质干细胞—聚乳酸乙醇酸共聚体复合物修复兔股骨髁软骨缺损的实验研究

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目的:以经体外扩增的兔异体滑膜间充质干细胞(SMSCs)为种子,加入纤维蛋白凝胶,以聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)为支架,以SMSCs-PLGA复合物的形式在体外用细胞因子诱导后进入软骨细胞分化谱系,回植入兔体内股骨髁软骨缺损处,探讨以此修复关节软骨损伤的可行性。方法:通过有限稀释单克隆培养法将兔的SMSCs由滑膜组织中分离出来加以纯化,在体外传代培养,并研究其形态学、超微结构、增殖动力学、分子表型、核型以及致瘤性等基本的生物学特性;同时将聚乳酸乙醇酸共聚物制备成型,并检测其生物安全性和组织相容性,评价其作为种子细胞支架的可能性和可靠性;将传代培养到第三代的种子细胞混合纤维蛋白凝胶,按一定密度注入到成型的聚乳酸乙醇酸共聚物支架中,将复合物放入生物反应器系统,加入BMP-2、TGF-β3和DEX诱导培养进入软骨分化谱系,以RT-PCR检测Ⅰ、Ⅱ型胶原及软骨特异性聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的mRNA表达,细胞免疫荧光化学染色检测细胞分化过程中Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达,碱性甲苯胺蓝细胞化学染色检测软骨特异性糖胺聚糖(GAG)的表达,以此来判断BMP-2、TGF-β3和DEX是否能够诱导SMSCs进入软骨细胞分化谱系;最后将经体培养扩增28天的种子细胞支架复合物,植入实验动物体内,12周、24周后取修复组织块行HE染色,碱性甲苯胺蓝染色,Ⅰ型、Ⅱ型胶原与S100蛋白的免疫化学组织染色,探讨以此修复兔关节软骨缺损结构和功能的可行性。结果:在体外培养条件下兔SMSCs的增生分裂能力十分活跃,可以通过离体培养使其实现数目的扩增;DNA含量检测、染色体核型分析、荷瘤实验结果表明,SMSCs是正常的二倍体细胞,无致瘤性,可作为软骨组织工程的种子细胞。本实验中作为支架的PLGA经组织切片和扫描电镜的观察表明是一种织网样结构,其表面及内部均含有丰富的微孔结构,分子量100000,平均孔径200-300um,孔隙率90%,厚2mm,与软骨细胞及SMCSs有良好的组织相容性,可作为SMCSs的支架材料。在体外,SMSCs-PLGA复合体在生物培养器中经BMP-2、TGF-β3和DEX协同诱导28天后,RT-PCR检测到Ⅰ型、Ⅱ型胶原及软骨特异性聚集蛋白聚糖(aggrecan) mRNA的表达,细胞免疫荧光化学染色也证实有Ⅰ型、Ⅱ型胶原的表达,同时碱性甲苯胺蓝细胞化学染色也证实有软骨细胞特异性胞外基质软骨特异性糖胺聚糖(GAG)成分,以上即证明SMSCs已进入软骨细胞分化谱系;SMSCs-PLGA复合物植入股骨髁软骨缺损区24周后大体观察原软骨缺损区有透明软骨样组织生成,HE染色可见透明软骨样结构,周围胶原纤维结构明显,排列规则;碱性甲苯胺蓝染色可见蓝色异染基质-GAG;Ⅱ型胶原与S100蛋白的免疫化学组织染色呈强阳性,未检测到Ⅰ型胶原。支架组和空白组分别仅发现纤维样组织和纤维软骨。结论:利用兔异体SMSCs经体外培养传代后,加入纤维蛋白后按一定的密度放入成型的聚乳酸乙醇酸共聚物支架,种子细胞支架复合体在添加有细胞因子的生物培养器中扩增28天,回植入关节软骨缺损区的方法,是一种较为可行的修复关节软骨损伤的方法。为进一步提高这一方法的有效性,还需要在生物材料科学、生物力学和生物化学等方面进行更为深入的研究。
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