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目的:表没食子儿茶素表没食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是绿茶中含量最丰富的成份,前期研究报道,EGCG具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤的作用,但其具体的作用机制还不明确。本研究旨在探讨EGCG抑制乳腺癌细胞迁移及炎症反应的分子机制,为EGCG的进一步开发及其在乳腺癌临床防治中的应用提供科学依据。方法:1.研究EGCG对乳腺癌细胞迁移的影响用不同浓度的EGCG(5μM、10μM、20μM、50μM、100μM)分别处理乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7,分别在24 h、48 h、72 h采用Alarmar blue染色法检测细胞活性,确定EGCG最适的作用浓度和时间。按照上述实验确定EGCG作用于乳腺癌细胞的合适浓度和时间,依次处理乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7,进行划痕和Transwell实验,进而探究EGCG对乳腺癌细胞迁移的影响。2.EGCG影响乳腺癌细胞迁移相关基因的表达EGCG处理乳腺癌细胞后,通过RT-q PCR和Western blot方法分别在m RNA水平和蛋白水平检测迁移相关基因E-cadherin、Vimentin的表达水平,同时检测肿瘤抑制基因SCUBE2的表达变化,分析SCUBE2与迁移相关基因表达的关系。3.证明EGCG是通过影响SCUBE2基因的表达进而抑制乳腺癌细胞迁移首先,利用免疫组化技术,在乳腺癌组织和癌旁组织中检测SCUBE2的蛋白表达水平,确定SCUBE2与乳腺癌发生发展的关系;然后,构建SCUBE2基因的sh RNA重组慢病毒载体,筛选得到干扰SCUBE2的稳转乳腺癌细胞系,检测干扰SCUBE2对E-cadherin和Vimentin基因表达的影响;最后,EGCG处理敲降SCUBE2的稳转细胞,采用划痕和Transwell实验检测其对细胞迁移的影响。4.确定EGCG对SCUBE2表达水平的调节是通过影响其启动子区DNA甲基化实现的利用重亚硫酸盐处理及克隆测序的方法,在乳腺癌组织和癌旁组织中检测SCUBE2启动子区的DNA甲基化水平差异。EGCG处理乳腺癌细胞后,与对照组比较,分析SCUBE2基因启动子区甲基化程度的改变,同时通过RT-q PCR和Western blot检测E-cadherin和Vimentin基因的表达,证明EGCG能够影响SCUBE2启动子区DNA的甲基化,进而影响乳腺癌细胞迁移相关基因的表达。5.探究EGCG对乳腺癌细胞炎症因子释放的影响EGCG处理乳腺癌细胞后,通过ELISA试剂盒检测细胞因子IL-6和MCP-1的表达水平;此外,采用STAT3信号通路抑制剂S3I-201预处理细胞后,再用含EGCG培养基培养,检测细胞因子的变化,分析参与EGCG抑制细胞因子释放的可能信号通路。结果:1.细胞活性检测结果显示,当EGCG浓度为20μM、作用时间达到24 h时,乳腺癌细胞活力受到显著抑制(p<0.05),因此本研究随后以此条件开展实验。划痕和Transwell结果表明,EGCG能够显著抑制LPS诱导的乳腺癌细胞迁移(p<0.01)。2.EGCG对乳腺癌细胞的抑制作用,伴随着迁移相关标志基因E-cadherin的上调和Vimentin的下调,此外,我们发现肿瘤抑制基因SCUBE2显著上调,由此我们推测SCUBE2基因可能与EGCG对乳腺癌细胞的抑制作用有关。3.免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,SCUBE2在乳腺癌组织中的表达明显降低,说明SCUBE2的低表达能够促进肿瘤的发生发展。干扰SCUBE2基因后,E-cadherin的表达下调,Vimentin的表达上调,说明SCUBE2在E-cadherin和Vimentin的上游对其进行调控。用EGCG处理干扰了SCUBE2的稳转细胞系后,我们发现EGCG的抑制作用减弱,证明EGCG是通过上调SCUBE2基因的表达进而抑制乳腺癌细胞迁移。4.SCUBE2启动子区的DNA甲基化程度在乳腺癌组织中显著高于癌旁组织(p<0.05),这与基因表达检测结果一致。EGCG处理乳腺癌细胞后,检测SCUBE2的甲基化变化,结果显示EGCG可以显著降低SCUBE2的甲基化比率(p<0.05),由此说明EGCG对SCUBE2表达水平的调节是通过影响其启动子区甲基化实现的。5.ELISA结果显示,EGCG处理能够显著抑制炎症相关因子(IL-6和MCP-1)的表达。用STAT3信号通路抑制剂S3I-201预处理细胞后,再用EGCG处理,我们发现EGCG对炎症相关因子表达的调控作用与单独S3I-201处理组相比变化不显著,因此,我们推测EGCG可能通过STAT3信号通路来调控乳腺癌相关炎症因子的表达。结论:EGCG通过影响SCUBE2启动子区的甲基化水平来实现对其表达的调控,SCUBE2进而通过调节迁移相关基因(E-cadherin和Vimentin)的表达,最终抑制乳腺癌细胞迁移。此外,EGCG可能通过STAT3信号通路来抑制的乳腺癌相关炎症因子的表达。