兔病毒性出血症和兔巴氏杆菌病是目前对养兔业发展构成极大威胁的两种重要传染病，分别由兔病毒性出血症病毒(Rabbithemorrhagicdiseasevirus,RHDV)和多杀性巴氏杆菌(Pasteurelamultocida,Pm)引起的。临床上两种疫病呈现出发病急、发病率和死亡率高，且常常出现混合感染，兔场发生这两种病时常导致巨大的经济损失。目前防控这两种疾病的疫苗主要为兔瘟、巴氏杆菌病的二联灭活疫苗，该疫苗存在使用剂量大、只产生体液免疫等缺点，研发新的疫苗十分必要。多表位疫苗是近年来借助生物技术研究的一种新型亚单位疫苗，可携带多个目标抗原，具备一苗多防、安全性好等特点。　　本研究旨在构建含有RHDV、Pm的主要保护性抗原多表位的原核表达载体，进行原核表达，研究重组蛋白的免疫保护效果，为研发同时防控兔瘟和兔巴氏杆菌病的多表位疫苗提供新思路。　　试验在分离鉴定RHDV和Pm毒株的基础上，PCR分别扩增RHDVVP60、PmOmpH和OmpA基因序列，采用BepiPred-2.0在线工具分析筛选三个蛋白抗原性强的表位区域，用柔性的连接肽Linker（Gly4Ser）3将其串联，优化编码表位蛋白的密码子后合成DNA序列；构建pET30a(+)-3epi原核载体，转入大肠杆菌BL21进行原核表达；纯化鉴定重组蛋白；用纯化的重组蛋白免疫家兔研究其免疫保护效果。结果如下：　　1.RHDVSZ/2016的鉴定及其VP60基因序列分析　　2016年到重庆石柱疑患RHD的某兔场采集样品，采用RT-PCR法检测样品中VP60基因，获得约为1.7kb片段，纯化后进行序列测定并分析。结果显示：该序列全长1740bp，共编码579个氨基酸，与GenBank上公布16株的RHDVVP60基因核苷酸同源性达94.9～95.9%，证明为兔瘟病毒（SZ/2016）。血凝试验显示SZ/2016毒株的血凝价为1:320。用1mLSZ/2016毒株（1∶10肝组织悬液）接种2Kg左右健康家兔，家兔于20h～48h发病死亡，表明SZ/2016毒株具有较强毒力。　　将测序的VP60DNA序列翻译成氨基酸序列，利用BepiPred-2.0在线工具预测VP60蛋白的抗原表位。结果显示VP60蛋白的B细胞表位主要位于4～86、230～258位氨基酸区域内。　　2.巴氏杆菌的分离及其OmpH、OmpA基因序列分析　　2016年到重庆石柱疑患兔巴氏杆菌病的某兔场采集样品，通过细菌分离、形态染色、生化及16SrRNA方法鉴定，证明分离株为多杀性巴氏杆菌（PmSZ/2016）。构建PmSZ/2016的16SrRNA基因系统进化树，表明PmSZ/2016菌株与GenBank上公布的12株参考菌株可分为两个族，其中与KX579747.1、MG597100.1等可聚为一族。用PmSZ/2016菌株测定了对家兔的最小致死量，结果为10CFU/mL。　　PCR法扩增PmSZ/2016的OmpH、OmpA基因，纯化后进行序列测定并分析。结果显示：OmpH基因全长1056bp，共编码351个氨基酸，与GenBank中公布的16株PmOmpH核苷酸序列同源性达98～99%；OmpA基因全长1062bp，共编码353个氨基酸，与GenBank中公布的14株PmOmpA核苷酸序列同源性达96～100%。　　将测定的OmpH、OmpADNA序列翻译成氨基酸序列，利用BepiPred-2.0在线工具预测OmpH、OmpA蛋白的抗原表位。结果显示OmpH蛋白的B细胞表位主要位于25～56、121～216、223～280、326～340位氨基酸区域内；OmpA蛋白的B细胞表位主要位于38～63、83～122、139～231、315～340位氨基酸区域内。　　3.表达载体pET30a(+)-3epi的构建及重组蛋白原核表达　　在分析RHDV（SZ/2016）VP60、Pm（SZ/2016）OmpH和OmpA蛋白的抗原表位的基础上；筛选了三个蛋白抗原性强的表位区域，VP60、OmpH和OmpA分别选取1～102、121～216、139～231位氨基酸区域。用柔性Linker按OmpA（aa139～231位）-Linker-VP60（aa1～102位）-Linker-OmpH（aa121～216位）方式串联；合成的序列长978bp，共编码323个氨基酸。将合成的DNA序列构建表达载体pET30a(+)上，转化大肠杆菌BL21；经菌液PCR、双酶切及测序鉴定表明表达载体pET30a(+)-3epi构建成功。　　将重组菌进行诱导表达，SDS-PAGE试验结果表明大肠杆菌BL21成功表达出重组目的蛋白，其分子量约为46Ku，纯化蛋白经SDS-PAGE分析显示蛋白质凝胶上只出现一条清晰条带，Western-blot检测结果显示重组蛋白可被RHDV和Pm阳性血清所识别。　　4.免疫原性研究　　用弗氏佐剂与重组蛋白乳化后的产物免疫20日龄健康家兔，0.25mg重组蛋白/只；分别在免疫后14、28、42天采血分离血清；用兔瘟和巴氏杆菌ELISA试剂盒检测不同时期家兔血清中RHDV和Pm的抗体水平，结果显示试验组家兔在免疫后两周均产生了抗RHDV和Pm特异性抗体，且抗体水平均随时间升高，于28天达到高峰并维持稳定。攻毒试验显示：在三免后第14天试验组家兔能抵抗1mL血凝价为1∶320的RHDVSZ/2016和1mL（10CFU/mL）剂量的PmSZ/2016活菌的攻毒，其保护率分别可达81%和63%。　　综上所述，本试验在获得一株兔瘟病毒和一株多杀性巴氏杆菌基础上。分析了RHDV（SZ/2016）VP60和Pm（SZ/2016）OmpH、OmpA序列，成功表达了含有RHDV、Pm的主要保护性抗原多表位重组蛋白，动物免疫试验表明重组蛋白能够同时诱导家兔产生针对这两种病原的中和抗体，本研究为开发RHDV、Pm多表位疫苗提供了一种新的思路。