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猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是当前引起猪腹泻的一种主要病原,自2010年在中国爆发以来,给中国乃至世界造成了严重的经济损失。PEDV属于RNA病毒,其变异较快,其抗原位点的变异是当前传统疫苗不能为仔猪提供很好保护作用的主要原因。另外PEDV较难分离,对其病原学的研究还不是很深入,目前PEDV只对Vero细胞敏感,但Vero细胞不属于猪源细胞,pAPN为PEDV的受体,Vero细胞上面缺乏这种受体。本研究检测了 2014-2015年间送至实验室的腹泻病料,并选择其中7份进行S基因测序,以了解当前流行毒株的变异情况。利用原核表达系统表达pAPN,制备了抗pAPN兔多抗。成功构建表达pAPN的Vero细胞系,为病毒分离和pAPN的研究奠定基础。具体研究内容如下:1.猪流行性腹泻病毒检测及分子流行病学调查本研究采用RT-PCR方法对2014年至2015年送至实验室的104份腹泻仔猪小肠组织病料进行检测,结果显示42份为猪流行性腹泻病毒阳性,选择不同地区的7份阳性病料进行S基因克隆和测序,并与Genbank已发布的PEDV S基因比对分析。核苷酸和氨基酸比对结果显示,7株流行毒株S基因核苷酸和氨基酸同源性分别是98.1%-99.2%,97.6%-99.1%。该7株流行毒株与经典毒株CV777和DR13核苷酸同源性分别为94.0%-94.2%,93.9%-94.1%;氨基酸同源性分别为93.1%-93.6%,92.5%-93.1%。S基因进化树分析结果表明根据S基因的变异情况PEDV可以分为三个型,本实验分析的7株PEDV流行毒株均属于Ⅲ型,与2012年以来中国流行毒株亲缘关系较近,与国外传统毒株和中国较早分离到的毒株亲缘关系较远。2.pAPN的原核表达及抗体制备氨基肽酶(AminopeptidaseN,APN)是多种冠状病毒的细胞受体,研究发现,猪氨基肽酶(Porcine Aminopeptidase N,pAPN)是PEDV的细胞感染受体。本研究将扩增到的pAPN基因克隆到原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-pAPN,用大肠杆菌BL21表达重组蛋白rpAPN,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白表达,结果显示重组蛋白得到表达且以包涵体的形式存在。用包涵体洗液纯化重组蛋白,经弗氏佐剂乳化后免疫家兔,经3次免疫后,宰杀家兔,分离血清,经ELISA方法测定其抗体效价,结果显示蛋白具有较好的抗原性,制备的血清含有高滴度的特异性抗体,该实验为后期对pAPN的研究奠定基础。3.pAPN细胞系的构建及pAPN活性研究为了研究pAPN对PEDV复制的影响和提高PEDV在细胞的感染量,本研究将完整的pAPN序列通过同源重组克隆入慢病毒表达载体pLVX-mCherry,并将该重组质粒 pLVX-mCherry-pAPN 与慢病毒包装质粒 pLP1、pLP2、pLP/VSVG 共转染 293T,在293T细胞中包装成含目的基因的慢病毒,收获重组病毒后感染Vero细胞,经过含有嘌呤霉素的营养液的培养,筛选出表达pAPN的细胞,通过RT-PCR和间接免疫荧光的方法(IFA)鉴定蛋白在细胞系中的表达。并利用单细胞克隆技术,成功筛选到一株单克隆,命名为Vero-APN-B6。将病毒感染细胞后,通过IFA和测定TCID50比较正常Vero和Vero细胞系对PEDV增殖的影响,结果表明该细胞系同正常Vero细胞相比能促进病毒的增殖。该细胞系的建立对于PEDV的分离、提高PEDV在细胞中的增殖奠定了物质基础。本研究调查了 PEDV流行毒株S基因变异情况,了解其与传统毒株抗原位点变异情况,为该病毒的致病机理的研究和防控奠定一定基础。利用原核表达蛋白制备了抗pAPN多克隆抗体、构建表达pAPN的Vero细胞系,并将多克隆抗体应用于细胞系的鉴定,该研究为PEDV的病原学特性研究提供条件。