自1990年Blease等成功进行了世界上第一例临床基因治疗（腺苷脱氨酶缺失病）以来，基因治疗（gene therapy）作为一种全新的疾病治疗方法备受瞩目，尤其是肿瘤基因治疗已经初步获得令人振奋的成果，例如重组腺病毒-P53，TK基因治疗恶性脑胶质瘤，IL-2基因工程胃癌细胞等。肿瘤基因治疗是将目的基因通过基因转移技术导入靶细胞，在靶细胞中表达该基因，从而发挥该基因的生物学功能抑制或杀伤肿瘤细胞，进而达到治疗肿瘤的目的。　　FADD(Fas-associated protein with death domain)，即Fas死亡结构域相关蛋白，是胞浆中介导细胞凋亡的死亡受体接头蛋白。研究发现，在一些人和鼠的癌细胞中可能缺失FADD蛋白，使得肿瘤细胞对受体介导的细胞凋亡获得抵抗，从而得以存活和增殖。因此可以通过基因治疗的方式，将FADD基因靶向到肿瘤细胞，使FADD蛋白在肿瘤细胞发挥生物学功能，诱导肿瘤细胞凋亡。　　研究发现，在体外，FADD蛋白可以发生自身聚集，在活细胞内，过表达的FADD蛋白也可以发生自身聚集，形成一种死亡效应纤维的结构(Death effectorfilaments)。有研究报道证实，该结构能够作为caspase-8的招募平台，直接招募并激活caspase-8，直接诱导细胞凋亡的发生。并且，该凋亡被认为是，独立于受体配体依赖的由FADD蛋白直接介导的新的凋亡方式。最近的研究发现，FADD蛋白的自身相互作用不仅由其DED结构域介导，而且也受到其可被磷酸化的“尾巴”，即C末端结构域调控。缺失DD结构域“C”末端结构域“尾巴”的FADD的变体更不稳定，更容易形成自身聚集体[5]。据此，本论文中，选取FADD变体中自身聚集作用最强，更容易形成蛋白聚集体的鼠源FADD突变体N-FADD(m-FADD1-196)，是缺失“C”端尾巴(m-FADD197-205)的鼠源FADD分子，作为目的蛋白，探究其肿瘤基因治疗的效果。　　目前肿瘤基因治疗面临着靶向性差，可控性弱，目的的基因表达量低等问题，因此，选取什么样的载体也是本实验的关键。沙门氏菌是一种常见的基因治疗载体，具有很好的肿瘤靶向性和安全性，它既可以表达原核质粒，又能携带真核质粒靶向肿瘤组织表达目的蛋白。二者各有利弊:原核表达具有的蛋白表达量高，质粒稳定性高等优点，但却存在获得的蛋白与天然蛋白在结构和功能上可能会有所差异的缺点;真核表达虽然获得的蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，但却面临着表达量低、质粒稳定性低、难以逃过细胞杀伤机制而无法释放质粒等困扰。因此，本论文选择VNP(PhoP/Q-)和VNP20009这两种沙门氏菌作为载体，分别携带真核和原核表达质粒，靶向肿瘤组织表达目的蛋白FADD和N-FADD，比较两种不同表达系统下的抗肿瘤效果。利用VNP(PhoP/Q-)携带真核表达质粒，不仅能提高质粒的稳定性，而且可以避免载体菌逃逸细胞杀伤机制的问题，使质粒在肿瘤细胞中成功释放，为外源蛋白作用的发挥加上了双保险。在VNP20009中使用携带nirB厌氧启动子的原核表达质粒，这一设计不仅可以大量表达目的蛋白，而且可以调控目的蛋白靶向低氧的肿瘤组织内表达，避免了目的蛋白对其他正常组织的损伤，达到了双重靶向的效果;因此比较两种体系下的抗肿瘤效果对进一步了解沙门氏菌作为肿瘤治疗载体的高效性有重要意义。　　第一章首先从细胞水平上验证了FADD和N-FADD促细胞凋亡的作用，接下来以VNP(PhoP/Q-)为载体携带真核表达质粒，探究了FADD和N-FADD在该真核表达体系的抗肿瘤效果。该两个真核重组质粒在B16F10细胞中的转染效率可高达70％左右。流式检测细胞凋亡结果表明，外源性转入FADD和N-FADD后均可明显引发细胞凋亡，而N-FADD与FADD相比并没有显著性差异。免疫荧光Caspase-3结果表明，FADD组与N-FADD组的Caspase-3的荧光强度虽然较空载质粒组有明显提高，但两者之间并无明显差异。Western Blot蛋白检测结果则显示，FADD组与N-FADD组在转染12h时，Caspase-3的活化体均上调。而转染12h，N-FADD组总的FADD（FADD及其变体N-FADD）的含量却比FADD组低，这预示着N-FADD较FADD有更好的促细胞凋亡作用。以VNP(PhoP/Q-)为载体的体内抑瘤率实验结果显示，该体系中，FADD与N-FADD均未表现出显著的抗肿瘤效果。　　第二章中我们以VNP(20009)为载体携带原核表达质粒，探究了FADD和N-FADD在该原核表达体系中的抗肿瘤效果。厌氧表达实验表明，在nirB启动子的作用下，VNP20009能够在厌氧环境下特异性表达外源基因，为其在肿瘤厌氧微环境中特异性表达目的蛋白奠定了基础;免疫组织化学、TUNEL凋亡检测和肿瘤靶向性实验证明，VNP20009介导的FADD和N-FADD基因在nirB启动子的作用下，可靶向肿瘤组织内高表达，并诱导肿瘤细胞凋亡，而不会对其他器官造成不良影响。体内实验表明，VNP-pN-FADD(VNP20009-pQE30-NirB-FADD)与VNP-pN-N-FADD(VNP20009-pQE30-NirB-N-FADD)均表现出显著地抑制肿瘤生长并延长荷瘤小鼠寿命的作用，并且N-FADD较FADD表现出更显著地抑瘤效果，更能延长小鼠的生存时间。以上结果提示:较真核表达体系而言，该原核表达体系能够明显抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的寿命，并且N-FADD较FADD具有更好的抗肿瘤疗效。　　综上所述，FADD和N-FADD在VNP20009携带原核厌氧表达体系下可以靶向肿瘤内表达，并且主要通过诱导细胞凋亡达到抑制肿瘤生长的目的，较FADD和N-FADD在VNP(PhoP/Q-)携带真核表达体系下有更好的抑制肿瘤生长的疗效;并且，N-FADD比野生型FADD具有更好的促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长的效果;VNP(20009)携带厌氧启动子原核表达N-FADD的组合是较理想的抗肿瘤组合。