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脂肪酶（E.C.3.1.1.3）是一种可以催化多种反应（如水解反应,酯化反应,酯交换反应等）的丝氨酸水解酶,并且广泛参与了工业上重要催化过程。随着工业的快速发展,人们对新型脂肪酶的需求日益强烈。来自南极假丝酵母的脂肪酶CALB是工业上使用最广泛的酶,它常被用于制备单一异构体手性药物以及合成可生物降解的聚酯等。研究发现,来自烟曲霉GIM 3.19的脂肪酶AFLB与CALB同源,存在较大应用前景。其酶学性质尚不清楚,分子结构亦未解析。本课题以脂肪酶AFLB为研究对象,研究了其重组酶的制备、酶学性质及三维结构的解析,并结合定点突变和分子动力学模拟等手段研究及阐述脂肪酶AFLB特殊的盖子结构和N末端亚结构域的结构与功能关系。这有利于对CALB家族脂肪酶更深入了解,并为其未来的蛋白质工程奠定了坚实的基础。主要研究内容如下:（1）脂肪酶AFLB的克隆表达与酶学性质表征通过反转录PCR,成功克隆了烟曲霉脂肪酶AFLB的基因aflb,并成功构建大肠杆菌胞内表达的表达载体pET28a-aflb及其表达菌株。在20°C,0.05mmol/L IPTG,200rpm诱导24h的条件下在大肠菌胞内成功表达了重组的脂肪酶AFLB,并且通过金属螯合亲和层析和阴离子交换层析纯化获得了纯度90%以上的重组蛋白,产率约为1 mg/L。脂肪酶AFLB酶学性质表征发现,脂肪酶AFLB是嗜温脂肪酶,最适合反应温度为40°C,在45°C以下的稳定性较高,最适反应pH为7.5。脂肪酶AFLB对高浓度的NaCl（6 mol/L）有着较强的耐受性,同时对非极性有机溶剂（正己烷、二乙醚和甲苯）展现了强耐受性,对极性有机溶剂（DMSO、甲醇、乙醇、丙酮和乙腈）和表面活性剂（Triton X-100、Tween-80/60/20、SLS和SDS）的耐受性弱。脂肪酶AFLB的最适底物是含的短链脂肪酸的三丁酸甘油酯,其次是中长链长脂肪酸的甘油三酯（C8-18）,同时具有严格sn-1,3位选择性。（2）脂肪酶AFLB晶体制备及其结构解析经过蛋白质预结晶实验确定了适合脂肪酶AFLB晶体生长的最优蛋白质浓度为12mg/mL。经过进一步的结晶条件的筛选,确定了脂肪酶AFLB晶体的生长条件为:环境温度为16°C,结晶液滴配方:10 mmol/L Tris（pH 8.0）,100 mmol/L NaCl和1.8 mol/L ammonium sulfate,采用悬滴法可以获得具有高衍射质量的晶体。通过分子置换的方法解析了脂肪酶AFLB的晶体结构,最终分辨率为2.0?。上传数据库后脂肪酶AFLB的晶体结构获得PDB ID:6IDY。脂肪酶AFLB的结构属于传统的α/β水解酶折叠（α/βhydrolase fold）结构,含有16个α螺旋和7个β折叠片。脂肪酶AFLB的催化三联体是由S233、D318和H361三个氨基酸组成“氧负离子洞”是由T169和Q234两个氨基酸主链上的NH构成。脂肪酶AFLB与同源脂肪酶CALB的α/β水解酶核心区域结构相似性较高,其中两者的235个主链α碳原子的RMSD=1.407?。脂肪酶AFLB“盖子”区域是一段带有二硫键的无规则卷曲的。处于“盖子”中部的W275的大疏水侧链深入在脂肪酶AFLB疏水性催化口袋内部,从而使疏水的催化口袋与极性的环境相隔开以保护酶在非工作状态下的活力。脂肪酶AFLB的N端亚结构域是其重要的特征之一,也是首次发现的该亚家族脂肪酶特有的N端亚结构域。从所在位置和二级结构的组成来看,脂肪酶AFLB的N端亚结构域与嗜热酯酶和CALA-like脂肪酶的“帽子”亚结构域有着一定的相似性。这预示着脂肪酶AFLB的N端亚结构域可能在酯类底物的识别过程发挥着重要作用。（3）脂肪酶AFLB盖子结构对酶活力的调控与脂肪酶AFLB野生型相比,AFLB盖子突变体对三醋酸甘油酯的Km值降低了30%至63%,kcat值提高了1.6至5.6倍;然而各个盖突变体的半衰期值(t1/2)和蛋白熔解温度（Tm）有着不同程度的下降,其中突变体AFLB-CALBlid和C273A/C281A的下降最为明显。这些结果表明,脂肪酶AFLB的盖子在保护酶稳定性中起着重要作用。通过盖子上单个关键氨基酸残基的突变（AFLB-W275A）或二硫键断裂（AFLB-C273A/C281A）,即可以明显地提高脂肪酶AFLB对甘油酯底物的亲和力和催化活性,但会损害其结构稳定性进而负影响热稳定性。（4）脂肪酶AFLB的N末端亚结构域对酶活力的调控缺失螺旋α1（AFLB-D1-25）和α1-α2（AFLB-D1-59）的AFLB突变体仍然可以在大肠杆菌宿主中成功活性表达。螺旋α1-α3以及包含残基60-128的更长片段的缺失导致AFLB可溶活性表达失败。突变体AFLB-D1-59对三丁酸甘油酯的比酶活是AFLB wt的2.14倍,但是其最佳反应条件（pH和温度）,耐盐性,热稳定性和底物特异性与野生型的相比没有明显差别。脂肪酶AFLB wt和AFLB-D1-59的对磷脂单分子膜形成的最大插入压力MIP值分别为14.59和58.66 mN/m。这表明,对于表面密度相同的磷脂单分子膜,AFLB-D1-59比AFLB wt插入到磷脂单分子膜的体积更大。同时,发现AFLB-D1-59的协同因子（0.6824）比AFLB wt（0.0298）的协同因子更高,表明了AFLB-D1-59更倾向与吸附至DOPC单分子膜上。由此推测突变体AFLB-D1-59水解活力提高的原因可能是:突变体对油水界面的吸附特异性提高,促进了整个水解反应的进行。AFLB wt和AFLB-D1-59的RMSD和RMSF接近,意味着N末端亚结构域可以稳定地附着于核心结构域,即使缺少N末端的1-59位氨基酸残基,酶分子的构象仍然保持稳定。然而48-62位氨基酸残基（IGKTEFSRSTKDAKS）在酶分子表面形成了一个较大、带正电荷和不规则的loop结构,可被内肽酶切断。因此,在自然环境中,脂肪酶AFLB N末端亚结构域的螺旋α1和α2可能通过被保留或被切除的方式介导酶的活性调控。