论文部分内容阅读
生长抑制激素(somatostatin，简称SS，中文翻译也简称生长抑素)和其受体(somatostatinreceptor，简称SSTR)是个多基因家族。生长抑素受体是七次跨膜受体，在脊椎动物的生长，发育和代谢中有着重要作用。本研究首从斜带石斑鱼中分别克隆了SSTR1，2，3和5的全长cDNA序列。运用RT-PCR和Southern blot检测了斜带石斑鱼SSTR2的表达情况后选取一些有代表的组织、胚胎、仔鱼不同发育阶段，再采用Real-time PCR技术比较分析了斜带石斑鱼SSTR1/2/3/5在成鱼各组织，胚胎、仔鱼不同发育阶段的表达分布。在体内外研究了SS对斜带石斑鱼垂体GH(growth hormone，生长激素)释放以及SSTRs，GHR1/2(growthhormone receptor，生长激素受体)和GH mRNA的影响。随后利用斜带石斑鱼垂体细胞原代培养系统，研究了SS-SSTR的调节机制和信号通路。在HEK293细胞中，利用荧光素酶报告基因分析了SSTRs介导的cAMP转录活性，最后利用荧光标记研究了受体的膜定位。
主要研究结果如下：
1.本研究克隆的斜带石斑鱼SSTR1，2，3和5的全长cDNA序列长度分别分2074bp，1841 bp,1886bp和1537bp，分别编码384aa(SSTR1)，381aa(SSTR2)，488aa(SSTR3)和391aa(SSTR5)。斜带石斑鱼的SSTR1，2，3和5与其它脊椎动物SSTRs结构类似。四个受体结构上都包括N端区域，七个跨膜区域，三个包外环，四个包内环和C端区域。在N端区域有糖基化位点，C段区域和包内环区域有多个磷酸化位点。七个跨膜内每个跨膜区上分别含有GN..V，NLA.AD，S...L...S.DRY，W..S.....P，F..P，F..CW.P和NS..NP..Y保守序列。四个受体的第一和第二个包外环的相似位置上分别有一个保守的半胱氨酸。此外，在SSTR1的氮端发现了一段由11个连续的丝氨酸“SSSSSSSSSSS”组成的序列。
与其它脊椎动物氨基酸序列同源性分析和进化树分析发现，斜带石斑鱼四个生长抑素受体有两个大的进化支：一支是SSTR1，另一支是SSTR2/3/5。SSTR2在进化过程中较为保守，而SSTR1，3和5进化中分歧较大。斜带石斑鱼SSTR1，2，3和5和已知的其他脊椎动物的相应受体分别展现了52.6-66.9％，61.2-72.2％，45.2-84.5％和49.3-58.4％的氨基酸序列一致性。但斜带石斑鱼四种受体间仅有34.1-46.7％的序列一致性。同源性分析表明斜带石斑鱼SSTRs在同一类型的受体间的同源性要比不同受体类型间的同源性高。此外，在http：//www.ensembl.org数据库中，利用tblastn工具，我们发现在斑马鱼，棘鱼，河豚和蛙的基因组序列中都含与哺乳类SSTR4类似序列。当在进化树中加入这些通过基因组推测来的编码蛋白后，鱼类和哺乳类一样都包括SSTR1/4和SSTR2/3/5两个大的进化支，而已经报道的虹鳟的SSTR1A和SSTR1B及斑马鱼的SSTR1A都与已知的哺乳类和鸟类的SSTR4归为一类。
2.通过RT-PCR结合Southern blot对SSTR2的表达研究表明，斜带石斑鱼SSTR2mRNA在中枢神经系统，垂体，卵巢，胃，肠，胸腺，视网膜和肝脏都有表达。在胚胎和幼鱼发育阶段斜带石斑鱼SSTR2 mRNA，在未受精的卵中有表达，但受精后母体携带的SSTR2 mRNA表达消失，原肠期开始表达，出膜时达到较高水平，此后的所有仔鱼期SSTR2mRNA都有表达。
利用定量的方法比较分析了斜带石斑鱼四种SSTRs在中枢神经系统的前脑，中脑，后脑，脊髓和垂体以及外周组织肝脏，胃，肠，胸腺，视网膜，卵巢共11个组织的表达特性。除了在胃肠没有检测到SSTR2和在视网膜没检测到SSTR5外，其他组织均有四种受体的表达。总的来说，SSTR mRNAs在中枢神经系统表达量要高于外周组织。端脑中SSTR1 mRNA的表达量最高，其他组织表达量相对较低。SSTR2 mRNA在垂体中表达量最高，其次是肝脏和端脑，然后是中枢神经系统的其他组织和外周组织。SSTR3 mRNA也是在垂体中表达量最高，在前脑，肝脏，胃中SSTR3 mRNA的量也很丰富。SSTR5 mRNA水平除垂体外其他组织均很低。
在斜带石斑鱼7个胚胎发育时期和5个仔鱼时期四种SSTR的表达变化很大。SSTR1和3mRNA在所有选择的时期都有表达，在囊胚和原肠胚期没有检测到SSTR2 mRNA的表达，在囊胚期没有检测到SSTR5 mRNA的表达。在胚胎阶段，SSTR1和SSTR2 mRNA水平在孵化阶段达到高峰，持续下降直到仔鱼孵出后第五天，表达量再次出现增加是在仔鱼孵出后第十五天，到了第48天SSTR2 mRNA到达第二个峰值，而SSTR1 mRNA却保持一个较低水平。SSTR3和SSTR5 mRNA的峰值出现在胚胎发育的脑泡形成期。在仔鱼孵化期和胚体形成期SSTR3和SSTR5 mRNA表达量也较高。孵化后SSTR3和SSTR5 mRNA水平都快速下降，随后从仔鱼孵出后第5天到第48天，SSTR3 mRNA水平逐渐升高而SSTR5 mRNA则保持一个很低的水平。
3.在体外，SS14和SS28均能在高浓度时抑制斜带石斑鱼垂体细胞GH释放，但SS14在低浓度时促进GH释放。SS14处理2.5h后，SSTR2，3 mRNA水平比对照组显著升高，并依赖SS14浓度，但对SSTR1，SSTR5，GHR2和GH却没有影响。SS28处理2.5h后，SSTR2，3和5 mRNA水平比对照组显著升高，并依赖SS28浓度，但对SSTR1，GHR2和GH却没有影响。GHRI mRNA表达则随着SS14和SS28浓度的增高而而显著地降低，同样依赖于浓度。
在体内，斜带石斑鱼腹腔注射SS144h后，垂体SSTR1，2，3和5 mRNA以及肝脏的SSTR1和SSTR3的mRNA水平比对照组显著升高，而肝脏GHR1和GHR2的mRNA水平比对照组显著降低，并都依赖SS14浓度。但垂体的GH，GHRs及肝脏的SSTR2，SSTR5的mRNA水平与对照组比较并没有显著差异。
在斜带石斑鱼原代培养的垂体细胞中，我们利用SS14处理前后PKC和ERK1/2磷酸化水平的变化证实SS14能够激活PKC和ERK通路，然后利用PKC通路的抑制剂CalphostinC和ERK通路的抑制剂U0126处理细胞，分析Calphostm和U0126对SS14抑制的GHR1mRNA及SS14刺激的SSTRs mRNA表达的抑制作用，分析垂体SSTRs介导的下游信号。
4.在瞬时转染了斜带石斑鱼的SSTR1，2，3，5表达载体的HEK293细胞中，与对照组相比SS14显著地抑制FSK刺激的荧光素酶报告基因的表达，抑制效果依赖的SS浓度，但不影响其本底表达水平。共转染了SSTR1和SSTR2的处理组要比单独转染等量的SSTR1或SSTR2的表达载体的细胞中SS对FSK刺激的荧光素酶报告基因的表达的抑制作用强且存在显著差异。同时构建了分别带有红色和绿色荧光标签的SSTR1和SSTR2表达载体，转染HEK293细胞证实两种受体可以共定位与细胞膜上，两种受体可能在细胞表面形成二聚体传递独特的信号。