红江橙黄龙病Nested-PCR检测及其内生可培养细菌研究

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本文对红江橙黄龙病的快速检测方法、红江橙苗木繁育基地与果园黄龙病带菌率及红江橙内生可培养细菌种群数量与种类差异等进行了研究。获得如下主要结果:1.红江橙黄龙病检测方法的筛选:选取已报道的柑橘黄龙病特异性引物,分别用rTaq DNA聚合酶和MightyAmp DNA聚合酶常规PCR以及Nested-PCR对红江橙黄龙病进行了检测,结果发现,在rTaq DNA聚合酶反应体系下常规PCR的检测结果的重复性、特异性、准确性等均不稳定;而在MightyAmp DNA聚合酶反应体系下,以CQULA03F/CQULA03R为引物的常规PCR以及Nested-PCR扩增的目的片段,其条带亮度较高、重复性较好、特异性也较强,表明该2种方法均可作为红江橙黄龙病的快速检测方法;其中Nested-PCR方法对反应体系中组分及酶的要求不高,稳定性好,且检测成本低,适宜大批次样本检测,为此,本文田间调查选用了Nested-PCR方法检测。2.用Nested-PCR法,对已显黄龙病症状的红江橙植株叶片、根、茎、果皮、果实等组织部位检测结果显示,各部位均可检测到特异条带,说明上述组织中均可携带黄龙病菌;进一步对表现为斑驳状、均匀黄花状、窄且无光泽状及花叶状叶片检测发现,其中以斑驳状叶片的阳性检测率达100%。因此,本文认为,表现有斑驳状叶片的植株可作为红江橙黄龙病田间诊断依据。3.本文对3个主要红江橙苗木繁育基地的嫁接苗、采穗母树(圃)和砧木苗共92份样品检测结果显示,3个苗圃的嫁接苗、采穗母树(圃)中均检测出黄龙病菌特异条带,其中嫁接苗带菌率23.9%(10.0%-36.4%),采穗母树(圃)带菌率21.2%(14.3%-25.0%),并从1个苗圃的砧木苗中检测出黄龙病菌特异条带。由此可见,红江橙苗木带菌率较高,可能是田间病原的主要来源之一。4.对廉江青平镇和红江农场共15个种植园461份样品检测结果表明,青平镇果园黄龙病带菌率为11.11%-28.89%,红江农场果园黄龙病带菌率为25.93%-30.76%;检测还发现,果园种植年限与黄龙病带菌率呈正相关,果园年限越长其果树带菌率越高,7年以上橙园黄龙病带菌率均达20%以上。5.用组织分离法,对经Nested-PCR检测后带菌与不带菌红江橙样本根茎叶部位进行内生可培养细菌分离,结果表明不带菌材料根茎叶部位内生菌数量均高于带黄龙病菌材料各部位的内生细菌数量,各部位菌量依次为健根>病根>健叶>病叶>健茎>病茎;依据细菌16SrDNA序列比对分析,不带菌材料17株内生细菌分属于10个不同的属,带菌材料15株内生可培养细菌也不属于10个属,二者内生细菌类群差异较明显;对各部位菌属和菌量统计结果分析,还发现带菌与不带菌材料各部位优势菌属数量和种类都发生了明显变化。由此可见,黄龙病菌入侵后,对红江橙各部位内生可培养细菌数量和种类均产生了较大影响。
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