骨形态发生蛋白(bone morphogehetic proteins, BMPs)是转化生长因子-p(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族的一员,最早在1960s从矿化的骨骼中提取出来,并发现其能够诱导异位骨的生长。BMPs是分泌型蛋白,存在于细胞外,并且可以在血清中检测到。细胞外的BMPs与细胞膜上的BMP受体(BMPR)结合后导致受体激酶的激活,活化的受体会磷酸化细胞内的Smadl/5/8,其与Smad4形成复合物后进入到细胞核内,结合到DNA序列上,从而调节BMP靶基因的转录。BMP-Smad信号通路受到多种机制的精细调节,尤其是受到一些负反馈调节作用,如受体的内吞,Smadl的去磷酸化和信号分子的降解等。BMP-Smad信号通路调节干细胞的自我更新和分化,细胞的增殖、迁移和凋亡,以及胚胎发育和出生后组织体内稳态的维持。BMP-Smad信号通路在肿瘤发生中也起着十分重要的作用。人和小鼠的遗传学研究已证明BMPs在成骨的增殖、分化和骨的形成中起着重要作用。BMP-Smad信号通路的缺失会导致骨相关疾病,如骨质疏松症。而我们在对DNA损伤应激反应的研究中发现,在DNA损伤和肿瘤发生中起重要作用的两个基因,毛细血管扩张共济失调突变基因(ataxia-telangiectasia mutated gene,ATM基因)和p53基因可能参与了成骨的分化。我们发现p53敲除小鼠和Atm敲除小鼠的成骨分化功能都受到了影响,p53敲除的小鼠表现为骨硬化症,而Atm敲除的小鼠表现为骨质疏松症,但是p53和ATM是如何调节成骨分化的,却不是很清楚。本研究是山东大学医学院人体解剖与组织胚胎学教研室与上海交通大学Bio-X研究院的合作研究项目,旨在研究BMP-Smad信号通路的一种新型调节方式以及BMP-Smad信号通路在p53-/-和Atm-/-小鼠骨代谢和成骨分化中的作用,并进一步研究阐明其作用机制,为骨相关疾病的治疗提供理论依据。本研究分四个部分进行：一、血清饥饿对Smadl的负反馈调节作用在长期利用小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)研究BMP-Smad激活的过程中,在加入BMPs处理之前,一般会先去除培养基中的血清进行血清饥饿。出乎意料的是,血清饥饿后Smad1蛋白的表达会发生上调。经过多种细胞系验证,我们发现血清饥饿导致Smad1增加是一种普遍现象,因此我们认为血清中可能存在着某种调节Smad1表达的物质。本研究通过Western Blot证明BMP抑制剂Noggin可影响Smad1的表达,提示是血清中存在的BMPs可能调节Smad1表达。我们发现在培养的MEF细胞中,降低培养基中的血清水平,加入BMP抑制剂Noggin或者转染Smad1的蛋白磷酸酶PPM1A都会导致Smad1蛋白水平的上调。采用细胞免疫荧光技术检测Smad1在细胞内的表达情况,结果显示Smad1主要定位在核周区域。进一步采用细胞核质蛋白分离实验证明,在血清饥饿作用下,Smad1在细胞质的表达增加。在DNA损伤作用下,Smad1在蛋白水平的上调对于正确诱导p53及抑制肿瘤发生是十分重要的。由此我们推测血清饥饿导致Smad1上调对于机体是十分重要的,因此我们进一步研究了Smad1表达上调的机制。首先,在COS7细胞中转染Smurf1,作为Smad1的E3泛素连接酶,正常情况下Smurf1会使Smad1发生降解,但是血清饥饿后对Smad1的表达却没有明显作用。其次,加入蛋白合成抑制剂放线菌酮后,分析Smad1蛋白的降解情况,结果发现抑制BMP2会使Smad1蛋白稳定性增加,并导致Smad1蛋白水平的上升。最后,为了探讨Smad1表达增加对细胞功能是否产生影响,我们采用Wst-1检测MEFs增殖的情况,结果发现抑制BMPs作用对MEFs的增殖没有明显的影响。同样,在MEF中过表达Smad1或者Smad1SXS对细胞的增殖也没有显著性影响。但是,通过比较正常血清培养和血清饥饿情况下,BMP2对Smad1激活作用,我们发现血清饥饿影响了Smad1活化的速度和幅度,即血清饥饿组Smad1活化作用更加持久,BMPs的作用更有效。这部分实验揭示了调节BMP-Smad信号通路一个全新的机制：去除或抑制BMPs会导致Smad1的稳定和重新定位,这些改变似乎对BMP2诱导的Smad1再激活的动力和幅度有影响,可以使Smad1活化更加持久。由于BMPs信号的强度主要是被Smadl SXS (ser-x-ser)氨基酸基序磷酸化的持久度和幅度体现,预测这种调节作用对于BMPs在机体各方面的作用都有影响。但是对于其功能及意义还需要进一步的探讨。二、p53在成骨分化中对Smadl的调节作用BMP-Smad信号通路在成骨分化过程中起着关键的作用。我们发现p53敲除小鼠的成骨分化增强,我们弄清这和BMP-Smad信号通路有无关系。为此,我们体外分离了p53+/+和p53-/-成骨细胞并进行了检测,结果显示,p53-/-成骨细胞的Smad1蛋白表达明显增加,这提示p53抑制Smadl的表达。采用实时定量PCR和荧光素酶报告实验证明,p53间接调节了Smadl转录。然后,考虑到p53通过靶基因p21抑制细胞周期蛋白CDKs,导致Rb的磷酸化下降以及E2F1的失活,从而抑制p53下游基因的转录。我们大胆推测：在成骨细胞中p53可能通过p21-E2F1通路抑制Smadl表达。利用Western Blot检测了p53-/-成骨细胞中p21的蛋白表达,结果显示p53-/-导致p21表达明显降低。而且在p53-/-成骨细胞中转染pMSCV-p21也挽救了Smad1的蛋白和mRNA水平。荧光素酶报告实验也证明p21抑制Smad1的启动子活性。以上这些结果表明p53通过靶基因p21调节Smad1的转录。最后,使用Genomatix的MatInspector软件预测发现在Smad1启动子有E2F1的结合位点,利用荧光素酶报告实验研究E2F1对Smadl启动子活性的影响,结果显示E2F1能明显激活Smadl-lkb的启动子活性。我们在小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞和人胚肺成纤维细胞IMR90-E1A中分别做了染色质免疫共沉淀实验,证实了E2F1是直接结合在Smadl的启动子上。我们进一步在成骨细胞中转染E2F1质粒,结果证明E2F1的过表达引起Smad1蛋白和mRNA水平的升高。上述的实验结果证明了p53对Smadl表达的调节是通过p21-E2F1通路来发挥作用的。三、ATM在成骨分化中对Smadl的调节作用在DNA损伤应答中,特别是DNA双链断裂时,ATM作为p53的上游影响p53的稳定性和活化。Atm-/-小鼠患有骨质疏松,并伴随成骨分化受到抑制。已有研究也证明ATM和p53都能调节成骨分化特异转录因子Osterix (Osx)的表达,但其调控OSX表达以及成骨分化的分子机制尚不清楚。目前也没有研究证明DNA损伤和成骨细胞分化存在着联系。为研究ATM调节成骨分化的分子机制,我们也检测了ATM对成骨分化相关信号通路BMP-Smad的调节。首先体外分离Atm+/+和Atm-/-成骨细胞,研究了在Atm敲除的情况下,BMP信号通路相关蛋白的表达情况。结果显示,Atm-/-成骨细胞中Smadl蛋白表达明显降低。由于在DNA损伤和肿瘤发生中,ATM是作为p53的上游,因此我们比较了Atm+/+和Atm-/-成骨细胞中p53和p21的表达,结果发现Atm-/-成骨细胞中p53和p21的蛋白表达明显增加。已有研究报道,在一些细胞包括成骨细胞中敲除ATM刺激活性氧(reactive oxygen species, ROS)增加,ROS会通过多种信号通路活化p53。因此我们推测可能是由于ROS水平增加导致了p53表达增加。接下来,我们在Atm-/-与Atm+/+成骨细胞中加入抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine, NAC)以降低细胞中的ROS水平,然后通过Western Blot检测p53的表达,结果显示：NAC降低了Atm-/-与Atm+/+成骨细胞中p53的表达。这提示Atm-/-成骨细胞中p53的表达上调可能部分是由于ROS的增加所导致的。为证明Atm-/-小鼠引起的成骨分化和骨形成缺陷是否由于p53上调所导致的,我们将p53+/-和Atm+／-小鼠合笼产生Atm-/-p53-/-小鼠,随后对该小鼠做了骨形成实验,结果显示：与Atm-/-小鼠相比,Atm-/-p53-/-骨量、骨形成速率、骨形成表面积和成骨细胞的数量均明显增加,实时定量PCR和Von Kossa染色显示Atm-/-p53-/-成骨细胞中ALP和Osx mRNA表达水平增加,骨的矿化明显增强。这些结果证明了Atm-/-小鼠引起的成骨分化和骨形成缺陷被p53敲除所挽救。据此我们推断Atm-/-小鼠的成骨分化和骨形成缺陷是由于p53上调导致的。为研究Atm-/-细胞中Smad1表达降低是否由p53增加所导致的,我们比较了正常、Atm-/-、p53-/-和Atm-/-p53-/-成骨细胞中p21、Smad1等蛋白的表达情况。结果显示,与Atm-/-成骨细胞相比,Atm-/-p53-/-中p21的蛋白表达明显降低,而Atm-/-p53-/-成骨细胞与p53-/-成骨细胞中Smad1的蛋白表达水平没有显著性差异,这表明敲除p53能够挽救Atm-/-成骨细胞中Smad1的表达和活化,提示ATM敲除引起Smad1表达降低是由于p53表达增加所导致的。本实验结果证明Atm敲除导致的骨质疏松可能是由于Atm敲除导致了p53表达上调,从而降低了Smadl的表达和活化进而影响了骨的形成。四、BMP-Smad信号通路在p53-/-和Atm-/-小鼠成骨分化中的作用Atm-/-和p53-/-小鼠中Smad1的表达都受到影响,这使我们想到p53信号通路和BMP-Smad通路可能存在着某种联系。我们在p53+/+和p53-/-成骨细胞中加入了BMP通路的拮抗剂Noggin/Chordin或者转染Smadl siRNA来抑制BMP-Smad信号通路,利用实时定量PCR检测了成骨分化相关因子的表达情况,结果表明p53-/-和WT成骨细胞的Osx和ALP mRNA水平都明显降低。在p53-/-成骨细胞中过表达p21,结果证明过表达p21抑制了ALP和Osx的mRNA表达,从而抑制了成骨细胞分化。以上结果证明了我们的推测,p53敲除导致骨硬化症是通过p21-E2F1导致Smadl表达增加所引起的。在Atm-/-成骨细胞中由于p53增加降低了Smad1的表达,而在Atm-/-p53-/-成骨细胞,由于p53的敲除挽救了Smad1的表达从而加速了成骨分化。我们在Atm-/-p53-/-成骨细胞中加入Noggin/Chordin来检测成骨细胞的分化情况,实时定量PCR和Von Kossa染色结果显示,Noggin/Chordin明显降低ALP和Osx的表达,抑制了骨的矿化。这表明Atm-/-p53-/-成骨细胞的分化增加是由于Smad1的表达和活化增加所导致的。结论：综上所述,我们在本研究中首次发现了调节BMP-Smad信号通路的一种新的机制,在抑制BMP作用后,Smad1表达上调并重新定位于细胞核周区域,这些改变对于Smad1的再激活有着重要的作用,但是由于在体内的机制十分复杂,我们仍然需要进一步的研究。另外,我们还发现了在成骨分化以及骨生成中,p53和ATM调节Smad1的表达以及成骨分化。ATM和p53在成骨分化中的作用和它们在DNA损伤应激反应/肿瘤抑制中相互作用关系是相反的。我们的研究建立了ATM-p53和BMP-Smad两个通路之间的关系,证明ATM-p53通过BMP-Smad调节成骨分化。