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研究目的:子宫内膜癌是女性最常见的妇科恶性肿瘤之一,近几十年来其发病率和死亡率正在增加。大量的国内外研究资料表明子宫内膜癌的发生与多种风险暴露因素有关,如:遗传因素、人体参数因素（如肥胖）、生活方式因素（如吸烟、饮酒、体育活动和日常饮食）、临床相关疾病因素（如糖尿病、多囊卵巢综合征）以及许多增加雌激素持续刺激的生殖因素（如产次、初潮年龄、口服避孕药、母乳喂养）。全子宫切除术加双侧输卵管卵巢切除术仍是目前子宫内膜癌治疗的首选方案,化疗及放疗是其辅助治疗方案。细胞外基质是一种由交联蛋白组成的纤维状复合物,对细胞的增殖、存活、分化和迁移起到至关重要的调节作用。胶原蛋白是一大类纤维蛋白,是构成细胞外基质的主要成分。胶原蛋白脯氨酰4-羟化酶（P4H）是维持胶原蛋白稳定性必不可少的酶。作为P4H的酶组分,失调的脯氨酸-4-羟化酶α（P4HA）与一系列病理过程有关,包括肿瘤的发生和进展。P4HA有三种亚型,分别是P4HA1、P4HA2和P4HA3。P4HA1广泛表达于多种正常组织及细胞中,P4HA2主要表达于成骨细胞和毛细血管内皮细胞中,P4HA3在正常组织中表达极低。近年来,相关研究报道了P4HA3在胃癌、头颈部鳞状细胞癌及乳腺癌等肿瘤中表达异常,但在子宫内膜癌中的表达情况、生物学功能及潜在调节机制目前尚无研究。NF-κB是一种多效性转录因子,其家族由五个成员组成:c-Rel（Rel）、Rel B、p65（Rel A）、p50/p105（NFKB1）和p52/p100（NFKB2）。NFKB1在多种肿瘤中广泛表达,并作为抑癌基因或癌基因存在。前期研究通过生物信息学研究预测了P4HA3可以被NFKB1转录调控。本研究旨在探讨P4HA3对子宫内膜癌的恶性生物学行为的影响,并研究NFKB1/P4HA3轴影响子宫内膜癌恶性生物学行为的内在机制。研究方法:通过q RT-PCR检测16例子宫内膜癌临床标本中癌组织及其邻近癌旁组织中P4HA3基因的表达情况,通过Western Blot检测16例子宫内膜癌临床标本中癌组织及其邻近癌旁组织中P4HA3蛋白的表达情况,通过组织芯片免疫组化分析检测子宫内膜癌组织及癌旁组织中P4HA3蛋白的表达情况。通过对美国癌症基因组图谱（TCGA）数据库中子宫内膜癌（UCEC）数据集的生存信息分析,探寻P4HA3与子宫内膜癌总生存及无病生存情况之间的关系。下调P4HA3后,通过CCK-8实验、Ed U实验及克隆形成实验来检测P4HA3在体外对子宫内膜癌细胞增殖的影响,通过Transwell实验来检测P4HA3在体外对子宫内膜癌细胞侵袭的影响,通过流式仪检测、TUNEL荧光染色实验及Western Blot检测凋亡相关蛋白来研究P4HA3在体外对子宫内膜癌细胞凋亡的影响。通过构建裸鼠皮下成瘤模型,观察下调P4HA3对子宫内膜癌细胞在裸鼠体内的成瘤速度及成瘤大小的影响。对裸鼠成瘤组织行免疫组化检测Ki-67蛋白的表达水平来分析P4HA3在体内对子宫内膜癌细胞增殖的影响。TCGA数据库下载UCEC数据集的基因表达谱数据,通过KEGG、GO及GSEA富集分析,进而预测P4HA3可能影响子宫内膜癌的上皮间质转化（EMT）。通过对EMT相关蛋白的Western Blot实验及免疫荧光检测,探寻在体外干扰P4HA3对子宫内膜癌细胞EMT的影响。通过对裸鼠成瘤组织的EMT相关蛋白的免疫组化分析,检测在体内干扰P4HA3后对子宫内膜癌细胞EMT的影响。通过生物信息学预测P4HA3可能受NFKB1转录调控,并预测其可能的结合位点。利用荧光素酶报告基因实验及RNA结合蛋白免疫沉淀实验验证P4HA3是否能与NFKB1相结合及其是否可以结合于预测的结合位点。利用q RT-PCR检测沉默及过表达NFKB1后P4HA3基因的表达情况,利用Western Blot检测沉默及过表达NFKB1后P4HA3的蛋白表达情况。下调NFKB1并上调P4HA3后,通过CCK-8实验、Ed U检测、克隆形成实验检测NFKB1/P4HA3轴对子宫内膜癌细胞增殖的影响,通过Transwell实验检测NFKB1/P4HA3轴对子宫内膜癌细胞侵袭的影响,通过EMT相关蛋白的Western Blot检测来分析NFKB1/P4HA3轴对子宫内膜癌细胞EMT的影响。结果:通过对16例子宫内膜癌中癌组织及癌旁组织的q RT-PCR检测及Western Blot检测,结果显示,相比于癌旁组织,P4HA3基因及蛋白在子宫内膜癌组织中均高表达。通过分析TCGA数据库中UCEC数据集的P4HA3的表达情况与总生存及无病生存情况之间的关系,结果表明P4HA3高表达患者的总生存及无病生存率均较低,同时根据子宫内膜癌分期进行分层分析,结果也表明,在不同的分期中,P4HA3高表达患者的总生存及无病生存率均较低。为了进一步研究P4HA3对子宫内膜癌恶性生物学行为的影响,通过敲低P4HA3后行CCK-8实验、Ed U检测及克隆形成实验,结果均显示下调P4HA3后子宫内膜癌细胞的增殖能力降低;行Transwell实验结果表明下调P4HA3后子宫内膜癌细胞的侵袭能力降低;行流式仪检测、TUNEL荧光染色实验及Western Blot检测凋亡相关蛋白实验结果均显示下调P4HA3后子宫内膜癌细胞的凋亡能力升高。裸鼠皮下成瘤实验结果表明,下调P4HA3后子宫内膜癌细胞的成瘤能力减弱。进一步对裸鼠成瘤组织进行与增殖相关的Ki-67蛋白的免疫组化检测,结果显示下调P4HA3后,Ki-67蛋白的表达降低,进一步说明下调P4HA3后异体移植瘤的增殖能力减弱。通过对TCGA数据库中UCEC数据集中P4HA3高表达患者的基因进行KEGG、GO及GSEA富集分析,结果显示其可富集于EMT通路,说明P4HA3可能与子宫内膜癌的EMT相关,进而行实验验证。通过Western Blot及免疫荧光实验检测下调P4HA3后子宫内膜癌细胞中EMT相关蛋白的表达情况,结果显示在体外下调P4HA3可以抑制子宫内膜癌细胞系的EMT。进一步通过对异体移植瘤组织进行EMT相关蛋白的免疫组化分析,结果也显示,在体内下调P4HA3后可以抑制子宫内膜癌的EMT。通过生物信息学预测,P4HA3可能受NFKB1的转录调控。通过荧光素酶报告基因实验及RNA结合蛋白免疫沉淀实验,我们证实了P4HA3可以与NFKB1在预测的位点相结合。进而通过q RT-PCR及Western Blot检测沉默NFKB1或过表达NFKB1后P4HA3的基因及蛋白的表达情况,结果表明,沉默NFKB1后P4HA3的基因及蛋白表达量均下降,而过表达NFKB1后P4HA3的基因及蛋白表达量均升高,说明NFKB1可以正向调控P4HA3的基因及蛋白表达。继而探索NFKB1对P4HA3的调控是否可以影响子宫内膜癌的恶性生物学行为。CCK-8实验、Ed U检测及克隆形成实验结果表明,下调NFKB1可显著抑制细胞增殖,而过表达P4HA3可以部分挽救这种抑制;Transwell实验证明下调NFKB1可显著抑制细胞侵袭,而过表达P4HA3可以部分挽救这种抑制;通过对EMT通路相关蛋白的Western Blot检测结果表明过表达P4HA3可消除NFKB1下调对子宫内膜癌EMT的抑制作用,而下调P4HA3也可挽回NFKB1过表达对子宫内膜癌EMT的促进作用。结论:相比于癌旁组织,子宫内膜癌组织中P4HA3基因及蛋白的表达上调,且较高的P4HA3的表达水平与较差的预后相关。下调P4HA3可以抑制子宫内膜癌细胞增殖、侵袭、EMT及促进凋亡,从而抑制子宫内膜癌的发生发展。P4HA3受转录因子NFKB1的转录调控,NFKB1/P4HA3轴可以影响子宫内膜癌细胞增殖、侵袭及EMT,进而影响子宫内膜癌的发生发展。因此,靶向NFKB1/P4HA3可能为子宫内膜癌治疗提供一种新的有前途的治疗策略。