谷氨酸是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，在高浓度时可产生兴奋性神经毒性，并在脑缺血损伤的病理生理机制中起重要作用。脑缺血损伤时，谷氨酸堆积主要来源于神经细胞的过度释放和谷氨酸转运体的逆转运。谷氨酸兴奋性毒性损伤机制复杂，大量的研究提示其主要与以下因素有关：钙超载，潜在的致命的第二信使及酶的激活，线粒体功能失调以及自由基的生成等等。 细胞凋亡是不同于细胞坏死的一种细胞死亡方式。脑缺血损伤可引起神经细胞坏死或凋亡，其死亡方式取决于刺激的性质和强度。体内缺血模型显示，在梗死中央细胞以坏死为主，而凋亡则在周边半暗带占著，而半暗带的存在是脑缺血后进行神经保护的主要原因。体外培养的神经元损伤模型则更加明确地显示神经元暴露于较高浓度的谷氨酸主要引起急性坏死，较低浓度主要引起迟发性凋亡。 氯胺酮是目前唯一应用于临床的非竞争性NMDA受体拮抗剂，实验证明它能通过阻断NMDA受体从而拮抗谷氨酸的兴奋性毒性。由于它有升高颅内压、脑血流、脑氧代谢率以及引起精神运动性副反应等缺点，长期以来其一直不被推荐用于脑损伤患者。然而近年来有学者指出，氯胺酮在适当条件下(如复合GABA受体激动剂，机控呼吸，避用N<,2>O)可安全用于颅内病变患者。咪唑安定是激活GABA<,A>/BZP受体复合体的常用静脉麻醉药，实验证明其也有脑保护作用。氯胺酮联合咪唑安定在临床麻醉中有着互补的优点，关于两者联合应用于脑保护的研究，在体内动物实验中已有报道，而在体外细胞培养模型中的研究尚少。 目的： 本实验以NGF诱导分化的神经元样PC12细胞为研究对象，以谷氨酸诱导细胞凋亡，模拟脑缺血损伤中的谷氨酸兴奋性毒性所致迟发性细胞损伤，通过MTT法检测细胞活力，Hoechst33258染色法及Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡，以探讨氯胺酮联合咪唑安定对谷氨酸兴奋性毒性损伤的保护作用是否较各自单独应用时增强，从而为临床上两者联合应用于脑保护提供理论依据，并为进一步的分子机制研究打下基础。 方法： 1．PC12细胞的培养及诱导分化 PC12细胞培养于含2﹪胎牛血清和8﹪马血清的DMEM完全培养液中，置于37℃、含5﹪CO<,2>及饱和湿度的细胞培养箱中培养，并以含50ng/ml神经生长因子(2.5s-NGF)的完全培养液诱导分化，隔天换液(含NGF)，四天后分化的神经元样PC12细胞即可备用。 2．实验分组以及检测将诱导分化的PC12细胞随机分成以下5组：C组：只加入完全培养液，不加任何其它处理因素。Glu组：加入含20mM谷氨酸的完全培养液。K组：加入含20mM谷氨酸+50uM氯胺酮的完全培养液。M组：加入含20mM谷氨酸+1uM咪唑安定的完全培养液。K+M组：加入含20mM谷氨酸+50uM氯胺酮+1uM咪唑安定的完全培养液。上5组细胞同时加药，并在细胞培养箱培养24小时后进行各指标的观察。采用四唑盐(MTT)比色法检测各组细胞的活力、Hoechst33258核染色法检测各组细胞凋亡情况、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术(FCM)检测各组细胞凋亡比例。 3．统计学方法本研究采用完全随机化设计，应用SPSS13.0统计软件，计量资料均以均数±标准差(x±s)表示，数据采用单因素方差分析法进行统计，各组间两两比较采用S-N-K过程。以P<0.05作为差异有显著性。 结果： 1．PC12细胞的诱导分化经50 ng/ml 2.5s-NGF诱导分化4天后，90﹪以上的PC12细胞分化为神经元样细胞，其突起长度大于细胞体直径的两倍以上。 2．MTT检测各组PC12细胞的活力改变 Glu组的PC12细胞经20mM谷氨酸孵育24 hr后，反映细胞活力的OD值较C组明显降低(P<0.001)；而K组和M组的PC12细胞分别经50uM氯胺酮和1uM咪唑安定的共孵育后OD值较Glu组明显升高(P<0,05)；而K+M组的OD值又比K组和M组进一步升高(P<0.05)；K组和M组之间OD值无明显差别(P>0.05)。 3．Hoechst33258染色法检测各组PC12细胞的凋亡情况 c组PC12细胞核呈现体积较大的弥散均匀的浅染核，偶见凋亡细胞核；Glu组可见大量体积明显缩小的深染核、新月形核，并可见两个或以上的DNA荧光碎片(与C组比较P<0．001)；而K组和M组的核固缩的程度较Glu组明显减轻(P<0.05)；而K+M组核固缩的程度又较K组和M组进一步减轻(P<0.05)；K组和M组之间无明显差别(P>0.05)。 4．Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测各组PCI2细胞的凋亡比例与C组比较，Glu组PC12细胞的凋亡比例明显升高(P<0.001)；K组和M组的细胞凋亡比例较Glu组明显降低(P<0.05)；而K+M组的细胞凋亡比例又较K组和M组进一步降低(P<0.05)；K组和M组之间无明显差别(P>0.05)。 结论： 氯胺酮和咪哗安定单独应用时可抑制谷氨酸诱导的神经元样PC12细胞凋亡从而发挥保护作用，而两者联合应用时保护作用进一步加强。