目的(1)评价APP/PS1双转基因AD小鼠模型效果,明确其发病进程和特点,为后续研究提供一种稳定的AD动物模型；(2)观察蓝莓提取物(Blueberry extracts, BB)干预对AD动物学习记忆损伤的作用,以及对Ap诱导海马神经元损伤的拮抗作用；(3)探讨BB上述作用的可能机制。方法AD转基因小鼠模型的建立：由两对APP/PS1小鼠繁育扩种,所繁殖的小鼠在40日龄时取鼠尾组织提取DNA,通过PCR扩增后琼脂糖电泳检测目标基因筛选出阳性小鼠；在7月龄时,分别对阳性小鼠和阴性小鼠进行Morris水迷宫实验测试,评价小鼠是否出现学习记忆能力损伤,之后取脑组织及海马组织进行HE染色和刚果红染色,观察是否出现类似AD的典型病理改变。BB改善AD学习记忆障碍的实验研究：(1)体外实验：培养新生大鼠海马原代神经元,设置正常对照组、Aβ组以及Ap+不同浓度BB组,以BB预孵育24h后,再以5μmol/L Aβ25-35处理24h模拟AD损伤,MTT法检测各组神经元活力,并确定BB干预的有效剂量;(2)体内试验：根据基因型检测结果,将小鼠分成阴性对照(CT,溶剂对照)组、模型(AD,溶剂对照)组和模型干预(AD+BB, BB150mg/kg-bw)组。在小鼠3月龄时,对各组施加相应干预,持续16周,观察其外观变化,记录摄食量,Morris水迷宫试验评价学习记忆能力；之后处死小鼠,称量小鼠主要脏器重量并计算脏器系数；对脑皮层及海马组织进行病理检查,并计数凋亡、坏死神经元数目。BB改善AD学习记忆相关机制的探讨：分别从细胞水平和整体水平进行研究。实验分组及处理同上。采用实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测MAPK/ERK信号通路分子ERK1/2、MEK2,甲基化酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b,组蛋白去乙酰化酶HDAC1、HDAC2、HDAC3,脑源性神经营养因子(BDNF)和泛素羧基末端水解酶(UCH-L1)的mRNA表达；采用Western blotting检测ERK1/2、MEK2、DBDNF和UCH-L1蛋白的表达；检测小鼠脑组织及血清抗氧化防御系统功能,包括MDA.SOD、还原型GSH和GSH-Px;采用电生理学方法检测小鼠海马CA1区长时程增强(LTP)。分别从抗氧化、细胞信号转导、表观遗传学及突触可塑性的角度探索蓝莓神经保护作用的可能机制。结果AD转基因小鼠模型的建立：Morris水迷宫检测结果显示,至7月龄时,APP/PS1小鼠定向航行试验需要耗费较长时间才能到达平台,对训练成果记忆稳定和牢固程度较差；空间探索试验结果显示,APP/PS1小鼠在目标象限区域的穿越次数明显少于正常对照小鼠,出现明显的学习记忆能力损伤。HE染色显示,7月龄的APP/PS1小鼠脑组织及海马CA1、CA3区均出现明显的神经元凋亡、变性,神经元减少；刚果红染色表明,阳性小鼠7月龄时脑组织已出现p淀粉样蛋白沉积斑块。BB改善AD学习记忆障碍的实验研究：(1)细胞实验显示,0.4μg/mlBB可以对抗Ap损伤,提高神经元活力,而4μg/ml及以上浓度的BB反而影响细胞生长,抑制细胞活力,并且随浓度的增高,细胞活力下降程度与BB浓度之间呈现剂量依赖关系。(2)动物实验结果表明,BB干预可减轻AD模型小鼠老化的部分症状和体征,明显缩短AD小鼠在定向航行试验中的潜伏时间,增加在空间探索试验中的目标区域穿越次数,抑制大脑萎缩,病理检查发现BB还能减轻AD模型小鼠脑组织神经元凋亡、坏死程度。BB改善AD学习记忆相关机制的探讨：(1)体外实验：Ap损伤可明显上调神经元ERK1/2、MEK2及三种HDAC的mRNA和蛋白的表达,同时抑制BDNF、UCH-L1的mRNA及蛋白的表达；BB干预后神经元ERK1/2、MEK2及三种HDAC表达上调的趋势得到明显抑制,而BDNF、UCH-L1的mRNA和蛋白表达明显增加。(2)动物实验：与CT组小鼠相比,AD小鼠脑组织中氧化损伤明显,BB可显著提高GSH-Px活性,升高还原型GSH,降低MDA水平。RT-PCR和Western blotting检测结果与细胞实验一致,AD小鼠脑组织ERK1/2、 MEK2和三种HDAC表达明显增高,但是BDNF和UCH-L1的表达明显减少。BB干预可有效抑制ERK1/2和MEK2的过度激活,减少HDAC的表达,上调BDNF和UCH-L1的表达。电生理学检测也显示,BB可以显著增强AD小鼠海马CA1区LTP。体外及动物实验均未发现AD状态下以及实施蓝莓干预对甲基化酶的表达存在显著差异。结论(1)该AD转基因小鼠模型繁殖阳性率较稳定,AD样病理及行为特征表现典型,是一种理想的AD动物模型；(2)BB具有拮抗Ap损伤、保护神经元以及改善AD转基因小鼠学习记忆能力损伤的作用,但是BB可能存在安全剂量范围,过高的BB浓度对细胞生长可能存在不良影响。(3)AD发病可能通过加剧脑组织的氧化损伤、诱导MAPK/ERK信号通路相关蛋白的过度表达和活化、改变某些表观遗传学特征、影响神经突触相关蛋白的表达,对脑功能造成进行性的损伤；而BB可以有效拮抗AD过程中的氧化损伤,调节MAPK/ERK信号蛋白的异常表达和活化,抑制表观遗传的异常改变,增强突触可塑性,从而发挥其神经保护功能。