杨树是我国重要的工业人工林树种,由于长期连作经营,导致林地生产力逐代下降,病害发生频繁,严重影响杨树生产的稳定和可持续发展。杨树是我国的主要绿化树种,每年产生的经济价值较高,但由于杨树病害的危害,造成了极大的经济损失。杨树真菌性溃疡病是严重影响杨树生产的重要病害,此病害显著降低了杨树的经济效益和生态效益。多年来对杨树真菌性病害的控制多采用化学防治的方法,利用各种化学杀菌剂杀死或抑制杨树真菌性溃疡病病原,但这种方法容易造成病原菌的耐药性,从而降低了对杨树真菌性溃疡病的防治效果,另外还会造成环境污染的加重。随着经济社会的快速发展和人们环保意识的增强,杨树病害的生物防治越来越受到关注和重视。本实验室从杨树中分离获得一株内生拮抗细菌N6-34。前期研究表明,该菌株发酵性状优异、拮抗效果好、抗菌谱广,对杨树溃疡病菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌等多种病原菌均有较强的拮抗作用。本研究通过菌落、菌体特征、生理生化特征结合16S rDNA、gyrB基因序列分析对N6-34菌株进行了鉴定;对N6-34菌株产生的抗菌活性物质进行了分离纯化,通过氨基酸分析、一级质谱、二级质谱等手段鉴定了活性物质的结构;研究了抗菌活性组分C17 fengycin B的理化性质;利用透射电镜、扫描电镜、高通量测序等技术研究了该菌株的防病机制。主要研究结果如下。(1)N6-34菌株的鉴定通过菌落、菌体特征,生理生化特征、16S rDNA序列分析及gyrB基因序列分析,将N6-34菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。(2)N6-34菌株产生的抗菌活性物质的分离纯化N6-34菌株发酵液经70%硫酸铵沉淀、甲醇抽提、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析、G25分子筛层析、分析型高效液相色谱,共分离获得14个组分;利用半制备高效液相色谱分别收集各组分进行活性检测和纯度检测,最终获得13个抗菌活性组分,各组分的纯度>95%。(3)N6-34菌株产生的抗菌活性组分的结构鉴别对N6-34菌株产生的抗菌活性组分进行一级质谱检测,组分2-14的分子量分别为1463、1491、1491、1505、1447、1475、1475、1477、1505、1491、1477、1489、1489Da;选择双质子离子峰作为前导离子进行二级质谱扫描分析,组分2、6、7、8、9和组分12获得fengycinA的标志性离子碎片分别为966和1080,组分3,4,5,10,11,13和组分14获得fengycinB的标志性离子碎片分别为994和1108。氨基酸组成分析表明,组分5氨基酸组成为Glx:Orn:Tyr:Thr:Val:Pro:Ile=3:1:2:1:1:1:1;组分6的氨基酸组成为Glx:Orn:Tyr:Thr:Ala:Pro:Ile=3:1:2:1:1:1:1。对组分5和组分6经二级质谱获得的多肽解离的系列离子进行解析,获得两种组分的完整序列如下:组分5:FA-Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Val-Pro-Gln-Tyr-Ile组分6:FA-Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala-Pro-Gln-Tyr-Ile其它组分的完整序列用同样的方法进行推导。(4)抗菌活性组分C17 fengycin B的理化性质研究了含量较高的活性物质组分5即C17 fengycin B的理化性质。结果显示,C17fengycinB在120℃高温下比较稳定;在p H小于6.0的酸性环境稳定性较强,在p H大于6.0的环境中稳定性较差;对不同强度的紫外线和各种蛋白酶不敏感;尖孢镰刀菌对C17 fengycin B比较敏感,MIC和MFC分别为6.25μg/m L和12.5μg/m L;葡萄座腔菌对C17 fengycin B最不敏感,MIC为25μg/m L,MFC大于50μg/m L。(5)N6-34菌株产生抗菌活性物质发酵培养基的优化单因素试验显示,N6-34菌株发酵产抗菌活性物质培养基最佳速效碳源、缓效碳源、有机氮源、无机氮源、无机盐分别为葡萄糖、玉米粉、黄豆饼粉、硫酸铵、磷酸二氢钾。通过PB试验、最陡爬坡试验、BBD试验,最终优化后的培养基配方为葡萄糖13.0g/L、玉米粉25g/L、黄豆饼粉为5.0g/L、硫酸铵10.0g/L、磷酸二氢钾0.7g/L。优化后的发酵培养基效价比基础培养基效价提高了250%。(6)N6-34菌株的抑/杀菌机制N6-34菌株对多种植物病原真菌均有不同程度的抑制效果;在普通光学显微镜下,对尖孢镰刀菌菌丝生长具有明显的抑制作用;抗菌活性物质对尖孢镰刀菌孢子萌发具有显著抑制效果;扫描电镜和透射电镜观察结果显示,N6-34菌株对多种病原真菌具有显著抑制作用。(7)N6-34菌株在杨树根、茎、叶及根际土壤的定殖特性用电击转化法将GFP基因导入N6-34菌株,研究了GFP标记菌株在杨树根、茎、叶及根际土壤的定殖特性。结果显示随着灌菌时间的延长,N6-34-GFP菌株在杨树根际土和杨树根、茎、叶中的定殖密度均呈现出先上升,稳定一段时间后又下降的趋势;激光共聚焦显微镜观察了N6-34-GFP菌株在根、茎和叶中的定殖部位,标记菌株在根中主要在分生区和伸长区定殖,在茎中的定殖部位主要在维管束内,在叶的横切面和纵切面中均有定殖;利用荧光定量PCR技术证实了N6-34菌株对尖孢镰刀菌的抑制效果。(8)N6-34菌株对杨树根际土和根表土真菌群落组成的影响通过Miseq高通量测序研究了N6-34菌株对杨树根际土和根表土真菌群落组成的影响。结果显示,N6-34菌株处理后的杨树根际土和根表土真菌群落的多样性、丰富度均发生了显著变化;根际土对照和处理在真菌群落结构方面呈现出显著性差异,而根表土对照和处理在真菌群落结构方面差异不显著。另外,根表土对照和根际土对照之间,根表土处理和根际土处理之间,在微生物多样性方面也存在显著性差异。