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一、研究目的侵袭性真菌感染（invasive fungal infections,IFIs）严重威胁免疫功能低下人群的健康,虽然医疗手段日益进步,但是IFIs的致病率和致死率始终居高不下。引发IFIs的常见病原菌包括念珠菌属、曲霉菌属和隐球菌属等,其中以白念珠菌感染最为多见。除了播散性的全身感染,在粘膜、器官以及各种生物材料表面形成生物被膜也是白念珠菌感染人体的常见方式,而生物被膜对目前临床上绝大部分抗真菌药物都高度耐药,给临床治疗造成很大困难。目前临床上对于IFIs的治疗仍然存在很多问题,一方面,临床用药选择有限,而且存在或肝肾毒性大或价格昂贵等问题;另一方面,随着现有抗真菌药物的长期使用,真菌耐药也逐渐成为影响临床治疗的重要问题。因此,寻找新型高效低毒的抗真菌化合物具有切实的意义。天然产物是药物发现的资源宝库。我们课题组前期在天然产物中筛选具有抗真菌活性的小分子化合物,发现血根碱（sanguinarine,SAN）具有强效的抗真菌作用,并且在进一步的研究中发现,SAN对生物被膜也有良好的抑制效果,而且抗生物被膜起效浓度低于其最低抑菌浓度。本课题全面考察了SAN的抗真菌活性,并研究了其依赖于浓度的抗真菌作用机制。二、研究方法与结果我们首先通过微量液基稀释法考察了SAN的抗真菌谱,发现其对临床常见致病真菌白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、新型隐球菌、烟曲霉菌以及红色毛癣菌都有较好的抗菌活性,最低抑菌浓度为0.4-6.4 mg/L,其中对白念珠菌的最低抑菌浓度为3.2 mg/L;另外,一些对氟康唑（fluconazole,FLU）耐药的真菌,SAN也表现出与对敏感菌类似的抗菌活性。为了进一步明确SAN的抗菌作用,我们选取白念珠菌和新型隐球菌为代表,进行琼脂平皿纸片扩散实验考察SAN的抑菌圈,并且绘制了SAN的杀菌曲线。结果显示SAN对两种菌都表现出剂量依赖的杀菌作用,3.2 mg/L SAN能够对白念珠菌产生显著的杀菌作用。随后我们进行了抗真菌后效应的测定,发现SAN存在剂量依赖的抗真菌后效应。我们用XTT法考察SAN的抗白念珠菌生物被膜作用,结果显示SAN在低于最低抑菌浓度的条件下（0.4-1.6 mg/L）即产生抗生物被膜活性;而且SAN不仅能够抑制初期生物被膜的形成,还能够破坏已经形成的成熟生物被膜,两种情况均具有剂量依赖性。我们进而利用小鼠白念珠菌感染模型考察了SAN的体内抗真菌活性,结果表明SAN能剂量依赖地保护真菌感染小鼠,1 mg/kg SAN在体内能够显著延长感染小鼠的存活时间并提高小鼠存活率。我们还对SAN的安全性进行了初步的考察,利用MTT法考察SAN对人脐静脉内皮细胞活性的影响,结果显示SAN对哺乳动物细胞的毒性相对较低,IC50值为7.8 mg/L,与对白念珠菌的最低抑菌浓度3.2 mg/L之间存在较大治疗窗,说明SAN对真菌的抑制作用具有一定的特异性。在对SAN抗真菌机制的探究中,我们分别考察了SAN在低浓度下（≤1.6 mg/L）的抗生物被膜机制和高浓度下（≥3.2 mg/L）的杀浮游菌机制。首先是抗生物被膜机制:我们进行细胞表面疏水性测定,考察SAN对白念珠菌粘附能力的影响,结果表明SAN能够剂量依赖地降低白念珠菌的细胞表面疏水性;然后我们用几种不同的菌丝诱导培养基考察SAN对菌丝形成的影响,结果显示SAN能够剂量依赖地抑制不同培养基中菌丝的形成;随后我们用实时荧光定量PCR实验考察SAN对菌丝和粘附相关基因表达的影响,发现SAN能够使cAMP通路相关基因ECE1、HWP1、HGC1、ALS3、CYR1的表达下调,提示SAN的抗生物被膜作用与cAMP通路受抑制有关;于是我们测定了SAN处理后白念珠菌细胞中cAMP的含量,发现cAMP含量显著降低,并且外源加入cAMP后白念珠菌的菌丝形成能力得到了恢复。其次我们研究了SAN高浓度下的杀菌机制:我们利用基因芯片技术和iTRAQ技术考察高浓度SAN处理后白念珠菌的基因组转录水平和蛋白质表达水平,结果发现氧化应激相关的基因和蛋白表达都出现明显的上调,提示细胞内发生了氧化应激;于是我们用DCFH-DA荧光探针测定了细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的含量,发现胞内ROS水平显著升高,而加入抗氧化剂后,SAN的杀菌作用明显减弱,证明SAN的杀菌作用与ROS水平升高有关;我们利用DAPI染料和TUNEL试剂观察SAN处理后染色体的凝集现象和DNA链断裂情况,说明SAN处理后细胞遗传物质受到了损伤,而加入抗氧化剂能使这种损伤减轻;最后我们用Annexin-V-FITC和PI染料考察SAN对白念珠菌凋亡和坏死的影响,结果显示SAN能够诱导白念珠菌发生凋亡,并且抗氧化剂的加入能够显著减轻SAN诱导凋亡的作用。三、研究结论SAN抗真菌谱广、杀菌作用强、具有良好的抗生物被膜活性、体内有效并且毒性较低,是较理想的抗真菌候选先导化合物。SAN在低浓度下（≤1.6 mg/L）通过抑制cAMP通路发挥抗生物被膜作用;而在高浓度下（≥3.2 mg/L）通过升高细胞内ROS,导致DNA损伤并且诱导细胞凋亡产生杀菌作用。