论文部分内容阅读
炎症几乎参与人类所有疾病的病理过程。人体主要的炎症细胞是血液中的白细胞,白细胞迁移到疾病部位并分泌促炎细胞因子(如TNF-α和IL-6)的能力对炎症的发展尤为重要,因此控制白细胞炎症因子TNF-α和IL-6的分泌是非常重要的。内毒素脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌外膜的有毒成分,大量进入血液循环可以与TLR4受体结合,诱导炎症细胞和血管内皮细胞释放关键炎症因子TNF-α等,并激活炎症级联反应。人肠碱性磷酸酶(IAP)通过灭活LPS,仅被用于治疗LPS引起的炎症性疾病。目前尚不清楚IAP是否有治疗非LPS依赖(即不通过TLR4受体)炎症性疾病的作用。为了研究IAP对人白细胞炎症因子TNF-α和IL-6释放的作用和IAP的非LPS依赖信号传导通路,本研究首先利用CHO表达系统制备高纯度重组人肠道碱性磷酸酶(rec IAP)。其次,利用人新鲜提取的白细胞建立炎症细胞模型,研究rec IAP在LPS存在和不存在的条件下对人白细胞TNF-α和IL-6的作用。最后,研究在中性p H下rec IAP生理底物的去磷酸化产物,包括ATP、ADP、AMP和腺苷等对白细胞分泌TNF-α的影响。本实验中使用人新鲜提取的白细胞研究rec IAP的相关功能,接近rec IAP在人体中实际的药学应用,具有重要意义。主要研究结果如下:(1)rec IAP在CHO的表达为获取高纯度rec IAP,使用CHO细胞进行表达,成功筛选出5株表达rec IAP的CHO稳定株。基于基础表达量和流加培养的结果,筛选出一株表达量最高的CHO细胞株作为种子细胞系,扩大培养并收取细胞培养液后浓缩纯化,获得rec IAP的分子量在70 k Da左右,纯度为92.45%,酶活为140.125 U/m L。(2)rec IAP对人白细胞TNF-α和IL-6的活性研究利用鲎试剂检测rec IAP对LPS活性的影响,验证了rec IAP灭活LPS是剂量依赖和p H依赖的。LPS诱导新鲜提取的人白细胞以剂量依赖性方式分泌TNF-α。结果显示,无论是LPS与rec IAP预处理后刺激白细胞,还是LPS和rec IAP同时刺激白细胞,都以相似的程度明显抑制白细胞TNF-α的分泌(p<0.05),表明rec IAP抑制白细胞分泌TNF-α的作用与LPS关系不密切。而且在LPS存在或不存在的条件下,rec IAP都显著抑制白细胞分泌TNF-α和IL-6(p<0.05),证明rec IAP抑制人白细胞分泌TNF-α和IL-6是非LPS依赖的。并且在生理p H下,rec IAP能使ATP脱磷并逐步生成ADP、AMP和腺苷。并且rec IAP可在LPS不存在的条件下通过使特定分子(例如ATP,ADP和AMP)脱磷酸产生游离腺苷抑制白细胞TNF-α的释放。以上结果证明了rec IAP非LPS依赖抑制人白细胞TNF-α和IL-6的作用,表明rec IAP不仅可以治疗与LPS相关的疾病,还有望成为与白细胞TNF-α和IL-6分泌有关疾病的治疗候选药物,扩大了rec IAP的临床应用范围。本研究进一步发现rec IAP使ATP脱磷产生腺苷并通过腺苷抑制人白细胞分泌TNF-α的非LPS依赖信号传导通路。此外,提取的牛小肠碱性磷酸酶(b IAP)与rec IAP相似,在LPS存在和不存在的条件下抑制人白细胞分泌TNF-α和IL-6(p<0.05),表明本实验中建立的炎症细胞模型具有一定的潜力,可作为一种稳定的活性检测法,用于测试商业化IAP药物。