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第一篇新生大鼠缺氧缺血性脑损伤改良模型的建立和鉴定目的本研究通过改良Rice的HIBD新生大鼠模型,建立稳定可靠的新生大鼠中、重度缺氧缺血性脑损伤动物模型,应用多种方法鉴定建模是否成功,降低传统制模方法中实验大鼠的死亡率,为HIBD的进一步研究提供可靠的实验动物模型。方法取7日龄新生Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机分三组,改良的HIBD模型(G组)、传统的Rice模型(C组)和对照组(S组),分别于建模后6小时、48小时、72小时取材,观察模型鼠行为改变、大脑解剖标本并使用HE染色、免疫组化、细胞凋亡鉴定建模成功与否。结果1.G组鼠建模时普遍出现全身性抽搐、右侧肢体抽搐、角弓反张及身体自发性左旋;而C组鼠只有少部分出现右下肢瘫痪及抽搐。2.G组SD大鼠左侧大脑半球呈现出现水肿、苍白、液化坏死的发生率约为63%,明显萎缩率达91%;C组建模后72小时仍无空洞及液化形成。C组与G组比较,左脑皮质及海马区水肿程度较轻,神经元数目减少不明显。3.G组HIBD后6小时可见左脑皮质NSE着色细胞呈现减少趋势,48小时NSE酶活性丧失达到高峰,72小时NSE酶活性渐恢复。G组HIBD后48小时凋亡最明显,72小时凋亡细胞及神经细胞数目仍减少,与C组比较有显著性差异(p＜0.01)。4.G组在缺氧结束后未见动物死亡。C组麻醉过程中死亡4只,缺氧过程中死亡8只。存活率有显著性差异(P＜0.01)。结论多种方法学鉴定了改良后的Rice建模方法在实验动物死亡率低、成功率高的基础上可以成功建立中、重度缺氧缺血性脑损伤动物模型。第二篇新生大鼠缺氧缺血性脑损伤对松果体功能的影响目的本实验通过观察松果体中褪黑素(MLT)合成酶芳香烷基胺-N-乙酰基转移酶(AANAT)、羟基吲哚-O-甲基转移酶(HIOMT)信使核糖核酸(mRNA)的表达,诱生型一氧化氮合酶(induce Nitric Oxide Synthase,iNOS)的表达与细胞凋亡的关系,了解松果体功能与HIBD的关系;放射性免疫法测定外周血MLT水平。方法将SPF级7日龄Sprague-Dawley(SD)随机分组,HIBD组(T)和假手术组(S)各30只,模型完成后第6、12、24、48、72小时5个时间点取松果体标本和心脏采血,每个时间点6只。电镜观察松果体形态学改变,测定各组不同时间点松果体中AANATmRNA、HIOMT mRNA的表达。观察松果体细胞的iNOS表达及细胞凋亡,放免法测外周血MLT的浓度。结果1.松果体中AANATmRNA的表达水平:HIBD后12小时、24小时、48小时AANATmRNA的表达水平均低于对应假手术组;纵向比较各假手术组之间AANATmRNA的表达水平无明显变化,HIBD后12小时开始下降,24小时达低峰,48小时有所回升,72小时恢复。2.松果体中HIOMTmRNA的表达水平:与对应假手术组相比,HIBD后各组HIOMTmRNA的表达水平无明显变化;纵向比较假手术各组之间及HIBD后各组之间HIOMTmRNA的表达水平均无明显变化。3.iNOS:新生鼠脑损伤后松果体的iNOS6小时、48小时含量与对应假手术组相比明显升高。4.细胞凋亡:脑损伤后松果体凋亡细胞早期明显增多,尤以6小时、48小时为主。5.电镜观察:脑损伤后松果体的形态学亦以6小时、48小时改变为明显,出现线粒体明显肿胀、粗面内质网极度扩张、细胞变性。6.血清MLT水平:与对应假手术组相比,HIBD后24小时,48小时血清MLT浓度水平降低;纵向比较假手术各组MLT浓度水平无明显变化,HIBD后24小时下降,48小时MLT水平与24小时基本相等,72小时恢复正常。结论1.HIBD可导致松果体中褪黑素合成的关键酶AANAT的基因表达下降,HIBD后12小时开始下降,24小时达低峰,48小时回升,72小时恢复正常;HIBD后松果体中褪黑素合成的最后一个酶HIOMT的基因表达水平变化不明显。2.HIBD可导致外周血MLT浓度减低,24小时开始下降,持续至48小时,72小时恢复。降低了MLT的内源性保护作用可能参与早期HIBD的发病机制。3.HIBD早期松果体功能下降,下调AANAT的基因表达是HIBD早期松果体功能下降的“引擎”。4.脑损伤后6小时、48小时松果体细胞的iNOS表达增加,以后逐渐下降,72小时基本恢复。.TUNEL法原位检测细胞凋亡与iNOS表达同步改变,iNOS表达对细胞凋亡有促进作用。iNOS表达和TUNEL法细胞凋亡参与了新生鼠缺氧缺血性脑损伤后松果体细胞形态学改变。第三篇外源性褪黑素对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的神经保护作用研究目的探讨褪黑素(melatonin,MLT)对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemicbrain damage,HIBD)的神经保护作用以及MLT的用药时间窗。方法选用7日龄的SD大鼠,随机分为假手术组(sham组)、模型组(HIBD组)、MLT治疗组(按给药时间分为HIBD前组、HIBD后0小时组、HIBD后1小时组、HIBD后2小时组)。建立新生鼠HIBD模型后,于不同时间点取材,脑组织分别行HE染色观察组织病理变化,原位末端标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUDP-biotin nick end labeling,TUNEL)检测皮质及海马神经元的凋亡,免疫组化法检测神经元特异性烯醇化酶(neurone specific enolase,NSE)的表达,心脏采血分离血清后用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)检测NSE的水平,并比较各组之间的差异。结果1.TUNEL法显示皮质和海马神经元的凋亡细胞于缺氧缺血后6小时渐增多,24小时达高峰,然后逐渐下降,MLT治疗组组间存在差异,但各组在6小时、12小时、24小时、48小时、72小时均显著低于HIBD组(p＜0.01)。2.脑组织中NSE的变化与血清中NSE的变化显著相关(r=-0.92),NSE在缺氧缺血后6小时开始升高,24小时达高峰后渐回落,MLT治疗组组间存在差异,但各组在6小时、12小时、24小时、48小时、72小时均显著优于HIBD组(p＜0.01)。3.MLT治疗组组间比较,HIBD前组、HIBD后0小时组、HIBD后1小时组各项指标的变化差异性不明显(p＞0.05),但它们与HIBD后2小时组在各项指标的变化上有显著性差异(p＜0.05)。结论1.褪黑素对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤有预防和治疗作用。2.脑组织中NSE的变化与血清中NSE的变化有显著的相关性,因此血清NSE的变化能够更便捷的显示HIBD脑损伤的情况。3.褪黑素对HIBD的治疗存在时间窗,预防用药和HIBD后2小时内给药效果明显,而且HIBD后1小时内给药优于HIBD后2小时给药。