褐飞虱Nilaparvata lugens(St?l)是我国水稻上的主要害虫,专一性吸食必需氨基酸缺乏的水稻筛管液。褐飞虱必需氨基酸的营养来源颇受关注,一般认为与体内共生菌有关。利用基因组和转录组数据,前人初步构建了褐飞虱及其体内类酵母共生菌(YLS)参与必需氨基酸的合成途径。组氨酸是必需氨基酸的一种,本文进一步对其合成途径的相关基因进行了克隆和来源分析,并利用RNAi技术研究了部分重要基因在褐飞虱生长、发育和存活中的作用。结果分述如下:1.组氨酸合成基因的克隆与来源分析本研究利用生物信息学手段,从褐飞虱类酵母共生菌基因组中预测得到合成组氨酸的7个基因,通过RT-PCR克隆得到了全部序列,分别命名为EdeHis1、EdeHis2、EdeHis3、EdeHis4、EdeHis5、EdeHis6和EdeHis7。序列比对、相似性分析结果表明这7个基因与真菌基因同源。系统进化分析表明7个基因均与肉座菌目真菌在进化关系上最为相近。采用褐飞虱中肠、头、足、体壁、卵巢和脂肪体c DNA作为模板,进行定量PCR分析,结果表明在含有类酵母共生菌的腹部脂肪体中的表达量显著高于中肠、头、足和体壁中的表达量。另外,利用褐飞虱头、翅和腹的基因组DNA作为模板,进行普通PCR扩增,在不含YLS的头和翅中不能扩增出片段。综合这些结果,我们认为克隆得到的这7个组氨酸合成基因均来源于YLS而非褐飞虱或者ARS。在此基础上,我们进一步构建了褐飞虱体内组氨酸合成通路。2.组氨酸合成关键基因EdeHis1的研究选择组氨酸合成关键基因EdeHis1进一步研究。注射浓度为0.05、0.5和1.5μg/μL的dsEdeHis1,不管是饲养于水稻苗还是缺组氨酸的人工饲料上,在第三天时,目的基因的表达量与对照相比均显著下调。两种食物对EdeHis1表达量的影响不显著(p=0.22)。另外,EdeHis1的沉默导致褐飞虱体内游离组氨酸含量显著低于对照组,且初羽化雌雄成虫的体重显著低于对照,表明EdeHis1参与了褐飞虱体内组氨酸的合成,且与褐飞虱的生长发育有关。通过注射和喂食不同浓度的组氨酸,发现组氨酸的缺失引起EdeHis1表达量的上调,而组氨酸的过量抑制其表达。但注射或饲喂不同浓度的外源组氨酸,褐飞虱体内的游离组氨酸与对照无显著差异,表明褐飞虱体内的组氨酸含量有一个动态调节机制。另外,利用原核表达的EdeHis1蛋白,经葡聚糖凝胶层析技术研究表明,外源组氨酸的存在导致EdeHis1构型由二聚体形式转变为六聚体。3.组氨酸合成基因EdeHis2及EdeHis6的研究EdeHis2、EdeHis6基因也是组氨酸合成中的重要基因,RNA干扰结果表明,注射dsEdeHis2或dsEdeHis6后,褐飞虱的死亡率显著升高、若虫发育历期有所延长,这表明干扰EdeHis2或EdeHis6对褐飞虱生长、发育、存活有一定的负面作用。另外,干扰EdeHis6后,部分褐飞虱表现为翅畸形,雌雄虫表现有所差异,其中雌虫有11%的翅发育不完全,雄虫有13%的翅呈现弯折,表明EdeHis6在褐飞虱翅发育中可能具有重要的作用。