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口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth diseasevirus，FMDV)引起偶蹄动物牛、羊、猪等的一种烈性接触性传染病。该病一旦暴发，感染率高，传播速度极快，引起大范围流行，造成巨大的经济损失。 目前对该病的防控主要依靠接种疫苗，FMD弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗具有良好的免疫原性，在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用。但常规疫苗存在病毒灭活不彻底，病毒逃逸，免疫后无法与自然发病的动物区分等因素，为FMDV的防控带来了困难，促使人们寻求一种更加安全有效的疫苗。随着分子生物学技术的飞速发展，基因工程疫苗如亚单位疫苗、合成肽疫苗、活载体疫苗、基因缺失疫苗、核酸疫苗等不断涌现，空衣壳亚单位疫苗是近年来研究的热点。FMDV空衣壳能够诱导与完整病毒粒子相同的免疫反应，由于不含非结构蛋白，免疫动物后可以通过检测非结构蛋白抗体来区分自然感染动物和免疫动物。空衣壳比病毒粒子更加稳定，免疫后不能在动物体内合成感染性的病毒核酸，不需要严格的病毒防范设施，具有较高的生物安全性。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)作为一种新的高效表达系统，无细菌细胞壁的热源问题，且具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。本实验选择在酵母表达系统中表达FMDV衣壳蛋白，以期获得高效的空衣壳抗原，用于研制新型基因工程疫苗，为未来口蹄疫的防治提供更加高效安全的防治产品。 根据GenBank中FMDV GD株全基因序列及该基因的酶切图谱和表达载体多克隆位点的分析，利用primer Premier5等软件分别设计合成了两对引物，上游引物添加限制性内切酶Xho I酶切位点，下游引物添加限制性内切酶Xba I酶切位点，以扩增FMDV P1-2A、3C基因。回收的目的基因片段与酵母表达载体pGAPZαA分别用xho I和Xba I双酶切，回收产物经T4连接酶连接后转化DH5α，抽提重组质粒pGAPZαA-P1-2A、pGAPZαA-3C，经PCR和双酶切鉴定成功。 将重组表达质粒和空载质粒分别用BIn I单酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切完全，纯化回收，电穿孔法转入巴斯德毕赤酵母菌SMD1168感受态，转化后菌液用预冷1M山梨醇30℃静置培养1h以上，加入1mLYPD溶液，30℃振荡培养1h后均匀涂布于YPDS(含100μg/mL ZeocinTM)固体培养基，置30℃恒温培养箱培养3d左右至单菌落出现，PCR检测P1-2A、3C基因是否与毕赤酵母染色体稳定结合。阳性转化子分别单独和共培养，SDS-PAGE和Western Blotting分析表达产物。试验结果表明，FMDV P1-2A、3C基因成功整合到酵母基因组染色体中，实现了分泌表达，3C蛋白酶成功切割P1-2A蛋白，且表达产物具有一定的免疫原性。