论文部分内容阅读
一、目的和意义微囊藻毒素(Microcystins, MCs)是淡水湖泊中由蓝细菌产生的一类天然毒素。其中以微囊藻毒素-LR (Microcystin-LR, MC-LR)急性毒性最强,危害最大。目前已有多种分析方法对水中的藻类毒素进行检测,它们是蛋白磷酸酶抑制试验、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)以及HPLC联用质谱法等。但由于水体中的干扰物质比较多,可能会影响以上方法最终检测结果的判定,通常需对样品进行前处理。传统的预分离方法是用反相C18柱富集水中的藻毒素,但许多研究表明反相C18柱预分离后的水样仍含有少量干扰物,故亟需一种分离效果更好的方法或技术。免疫亲和层析以其具有分离复杂样品中靶物质的高度特异性和高效性特点被大家所关注。本文将探讨构建藻毒素免疫亲和层析柱制备过程中的主要影响因素,包括：抗体(配体)的纯化,载体的选择、偶联抗体的最佳浓度,配体与载体的偶联时间、载体残留活性基团的封闭时间等,以建立一种特异性高、吸附性能好、洗脱分离完全的免疫亲和层析预分离藻毒素的方法,为环境水体中藻毒素的筛选与检测探索新方法、创建新技术。二、方法1.采用饱和硫酸铵方法纯化抗微囊藻毒素的多克隆抗体,用紫外分光光度法检测纯化浓缩后的抗体浓度,间接ELISA测定抗体效价。以纯化后的抗体配体和交联琼脂糖凝胶-4B(Sepharose CL-4B)作为载体,用活化剂N,N’-羰基二咪唑(CDI)活化载体,然后在硼酸缓冲液中促使活化的载体与配体偶联。分别从偶联的抗体浓度、偶联时间、封闭时间上优化免疫亲和柱的制备条件。测定偶联率和配体结合量。免疫亲和柱吸附藻毒素后,采用甲醇作为洗脱剂,并筛选最佳洗脱体积。从柱容量、柱抗体与抗原的特异性、柱间差异等方面对所制备的免疫亲和柱进行评价。2.运用所制备的免疫亲和柱联用ELISA方法测量环境水体中藻毒素的含量,并同C18柱的吸附效果相比较。在水样中加入定量的标准品MC-LR测量加标回收率,检测免疫亲和层析联用ELISA方法的准确性。三、结果紫外分光光度法检测纯化浓缩后抗体的浓度为85.78mg/ml,用间接ELISA方法测定抗体效价介于1：16000-1：32000之间,抗体的亲和常数介于2.798×107-5.596×107之间。免疫亲和层析的制备过程中,偶联抗体的浓度确定为8mg/ml,偶联时间为24h,封闭条件为pH 8.0、1.0mol/L乙醇胺封闭4h。免疫亲和柱吸附藻毒素过程中,洗脱液CH3OH的体积确定为10ml。本实验所制备的免疫亲和柱对藻毒素具有特异性吸附作用；柱容量在233.1ng-284.5ng之间；柱间差异较小,标准差为97.27%±2.86%,变异系数为0.029；同一免疫亲和柱对标准品的回收率达95%左右。免疫亲和柱对环境水样中藻毒素的吸附效果与国家规定的标准C18柱效果一致。免疫亲和柱联用ELISA方法检测水样加标回收率分别是75.97%±2.7%,72.49%±2.1%。四、结论纯化浓缩的抗体亲和常数介于2.798×107-5.596×107之间,满足免疫亲和层析抗体亲和常数需介于107-1012之间的要求。制备的免疫亲和柱对藻毒素具有特异性吸附作用。亲和柱间差异很小,变异系数为0.029。免疫亲和柱吸附效果与国家标准反相C18柱比较无显著性差异,吸附效果肯定。