论文部分内容阅读
目的:阻塞型睡眠呼吸暂停（Obstructive sleep apnea,OSA）是睡眠期间反复出现上气道塌陷的睡眠呼吸障碍性疾病,人群中发病率达9%-38%,高龄人群中更是高达49%。颏舌肌作为最重要的上气道扩张肌之一,其对上气道开放的维持至关重要。然而,研究表明,与正常对照组相比,OSA患者睡眠期间颏舌肌的肌电图（Electromyogram,EMG）活性明显减低。大约三分之一的OSA患者存在夜间颏舌肌反应性下降,即会厌负压每增加一厘米水柱时颏舌肌EMG活性的最大增幅小于0.1%。由此可见,上气道开放肌的功能失衡是OSA发病的重要机理之一。那么,可改善上气道扩张肌功能的口咽部肌功能训练是否会是OSA的有效治疗方法呢?既往研究表明口咽部肌肉训练可降低中重度OSA患者呼吸暂停低通气指数（Apnea hypopnea index,AHI）,并改善其白日嗜睡、睡眠紊乱及主观打鼾症状。我们课题组前期对10名中度OSA患者进行舌肌功能训练一周后,发现与对照组相比,舌肌训练组OSA患者夜内整体AHI降低,但治疗组中各个OSA患者疗效不一,其中63.6%的OSA患者疗效较好,而其余患者则疗效欠佳。目前研究者推测,OSA患者之所以能获益于口咽部肌肉训练,除了肌肉本身所发生的收缩功能和解剖结构的改善外,究其根本可能来源于舌肌的中枢及外周神经可塑性的调节。而关于舌肌训练是先引起皮质运动中枢可塑性还是先增加肌肉EMG活性,目前尚无定论,且尚无研究深入探索口咽部肌肉训练对上气道稳定性的动态影响。脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）作为重要的神经营养因子之一,被证实可调节轴突生长、神经元存活和分化,在认知、学习和记忆中有着重要作用。我们课题组先期实验亦发现8周的舌肌力量训练（Tongue strength training,TST）训练可使大鼠舌下神经核内的BDNF及其高亲和力受体——酪氨酸激酶受体B（Tyrosine kinase receptor B,Trk B）的表达同时增高。那么舌肌训练的获益是否是基于BDNF合成依赖的神经可塑性?细胞外调节蛋白激酶（Extracellular signal-regulated kinase,ERK）是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,可被神经营养因子及神经递质等多种信号激活,在神经可塑性、细胞增殖分化及认知学习方面起着至关重要的作用。BDNF与其受体Trk B结合后,通过增加Trk B受体第515位点磷酸化,促进ERK由细胞核向细胞质易位,ERK被激活后又可增加环磷腺苷效应元件结合蛋白（c AMP-response element binding protein,CREB）第133位点磷酸化,随后其可上调即刻早期基因表达、促进细胞骨架蛋白合成,而且能促进树突生长及分化。有学者将癫痫模型鼠进行4周的肌肉训练,发现训练组大鼠癫痫发作的次数较对照组明显减少,同时,训练可逆转大鼠海马中癫痫所致的ERK及CREB表达减少。既往研究亦发现4周的力量训练能挽救链唑霉素所致的小鼠的空间记忆能力损伤,究其根本,发现这一改善可能源于海马中ERK、CREB活化水平的提高。以上发现提示运动训练可能通过BDNF与Tr KB结合后激活ERK-CREB增强中枢可塑性,并最终改善认知、记忆及相关神经系统功能。那么,BDNF亦是否通过Trk B—ERK—CREB这一信号通路来介导TST对颏舌肌中枢兴奋性及上气道稳定性的改善呢?目前尚无相关报道。因此,本研究旨在通过应用腺相关病毒（Adeno-associated viral,AAV）转染、舌下神经核内微量注射、上气道临界闭合压测定、经颅磁刺激、颏舌肌肌电记录等技术探讨BDNF对舌肌训练大鼠伸舌力量、颏舌肌中枢调控以及上气道动力学的影响。并通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR）、免疫组化、及免疫荧光技术分析舌肌训练前后各组大鼠舌下神经核内Tr KB、ERK、CREB的m RNA及蛋白表达水平,并进一步通过舌下神经核内微量注射ERK或CREB抑制剂,检测其对训练大鼠的颏舌肌经颅磁刺激（Transcranial magnetic stimulation,TMS）反应性、上气道稳定性等影响来探讨BDNF影响舌肌训练后大鼠颏舌肌中枢兴奋性及上气道稳定性的相关机制。方法:1.探讨BDNF对舌肌训练大鼠颏舌肌中枢调控和上气道的影响选取SPF级雄性SD大鼠84只,随机分入正常对照组（Normal control,NC,n=12）,TST组（n=12）,TST+注射PBS组（TST+PBS,n=12）,TST+注射Tr KB-Fc组（TST+Tr KB-Fc,n=12）,TST+注射AAV-EGFP组（TST+AAV-EGFP,n=18）以及TST+注射AAV-BDNF组（TST+AAV-BDNF,n=18）。所有TST组大鼠在适应性限水5天后,开始按照预设的逐渐增加的阻力阈值、训练时间及每日训练总量阈值执行8周的抗阻-取水训练,具体为大鼠通过伸舌按压连有压力传感器的直径为18mm的圆盘,当按压力量达预设的压力阈值后则由配套软件控制步行电机推出约0.02ml左右蒸馏水至圆盘使大鼠得以取水,训练组大鼠每日取水压力阈值为最大自主伸舌力量的50%-80%,训练时间为10-30分钟,每天每只大鼠伸舌做功为1000-3000 g.s。每天每只大鼠伸舌做功为1000-3000 g.s.对于TST+PBS以及TST+Tr KB-Fc组,在舌肌训练前,参考大鼠大脑立体定位图谱,通过大鼠大脑立体定位仪（68005,深圳瑞沃德）定位大鼠舌下神经核核团（前囟后13.4–14.5mm,旁开±0.2-0.3 mm,深度8.2-8.6 mm）并置入微量注射装置。待大鼠术后恢复4-5天后开始进入限水周期,并于训练期间每天给予BDNF中和剂-Tr KB-Fc（0.5μg/μl,60nl/侧）或PBS（0.01 mol,60nl/侧）。对于TST+AAV-EGFP及TST+AAV-BDNF组,在舌肌训练前,定位大鼠舌下神经核核团,进行AAV8-h Syn-EGFP或AAV8-h Syn-BDNF（47425-1,上海吉凯）注射,注射体积0.5μl/侧。3周后两组大鼠每组随机选取6只大鼠断头取脑进行舌下神经核内BDNF的m RNA及蛋白表达水平检测。其余12只大鼠进入限水周期并开始舌肌力量训练。所有组大鼠分别在训练的第0天、2周、4周、8周进行舌肌功能行为学评估,Pcrit、颏舌肌肌电EMG和颏舌肌运动皮质区TMS反应性检测。每个检测时间点分别在第5min、20min、40min、80min和120min连续记录TMS以及EMG变化。训练8周后对所有大鼠进行直接断头取脑切取舌下神经核进行RT-PCR分析BDNF m RNA表达水平,或者行脑组织灌流取材及标本切片术,通过免疫组化或免疫荧光技术比较各组大鼠舌下神经核中BDNF蛋白水平情况。2.探讨BDNF影响舌肌训练后颏舌肌中枢兴奋性及上气道稳定性的相关机制本部分实验中,首先检测NC组、TST组、TST+PBS组、TST+Tr KB-Fc组、TST+AAV-EGFP组及TST+AAV-BDNF组舌下神经核内Tr KB、ERK1/2及CREB m RNA表达水平以及Tr KB、ERK、p-ERK、CREB及p-CREB的蛋白表达情况。然后,选取SPF级雄性SD大鼠40只随机分入NC（n=8）,TST组（n=8）,TST+PBS（n=8）,TST+注射PD98059组（TST+PD98059,n=8）以及TST+注射KG-501（TST+KG-501,n=8）。于舌下神经核定点微量注射ERK抑制剂或CREB抑制剂,检测舌肌训练大鼠颏舌肌中枢反应性（经颅磁刺激+颏舌肌肌电图）和上气道动力学（上气道闭合压）,舌肌训练造模、注药组定位注射方法及颏舌肌中枢反应性等检测方法同前。结果:1.探讨BDNF对舌肌训练大鼠颏舌肌中枢调控和上气道的影响（1）力量训练可逐渐增加TST组大鼠的最大自主伸舌力量。与NC组相比,TST组的TMS潜伏期缩短、颏舌肌EMG活性增高,且TMS潜伏期缩短的程度以及EMG活性增高的幅度随着训练时间的延长而增加,同时这种兴奋性的持续时间逐步从20分钟逐渐延长至80分钟。其次,TST组在训练第4周和第8周的Pcrit值均较对照组明显降低（P<0.05）。8周TST后,训练组舌下神经核内BDNF的m RNA及蛋白水平均较对照组明显升高（P<0.05）。（2）与单纯TST组相比,舌下神经核内阻滞BDNF后大鼠自主伸舌力量稍有下降,舌肌训练所致的颏舌肌中枢TMS反应性的增强作用下降,表现为TMS潜伏期延长（P<0.05）,舌肌训练所致的颏舌肌EMG活性、上气道可塌陷性增高作用削弱（P<0.05）。同时,8周舌肌训练后,TST+Tr KB-Fc组舌下神经核内BDNF的m RNA及蛋白水平较单纯TST组相下降（P<0.05）。（3）与TST+AAV-EGFP组相比,舌下神经核内过表达BDNF后大鼠自主伸舌力量略升高,舌肌训练所致的颏舌肌中枢TMS反应性的增强作用升高,表现为TMS潜伏期缩短（P<0.05）;舌肌训练所致的颏舌肌EMG活性、上气道可塌陷性增高作用增强（P<0.05）。相应地,8周训练结束后,与TST+AAV-EGFP组相比,TST+AAV-BDNF组舌下神经核内BDNF的m RNA及蛋白水平均明显升高（P<0.05）。2.探讨BDNF影响舌肌训练后颏舌肌中枢兴奋性及上气道稳定性的相关机制（1）8周舌肌训练后,与NC组相比,TST组舌下神经核内Trk B、ERK1/2、CREB的m RNA水平增高,Trk B、ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB的蛋白水平增高（P<0.05）。（2）与单纯TST组相比,舌下神经核内阻滞BDNF后大鼠舌下神经核内由舌肌训练所致的Trk B、ERK1/2、CREB的m RNA及蛋白水平上调作用减弱（P<0.05）。（3）与TST+AAV-EGFP组相比,舌下神经核内过表达BDNF后大鼠舌下神经核内由舌肌训练所致的Trk B、ERK1/2、CREB的m RNA及蛋白水平上调作用增强（P<0.05）（4）与单纯TST组相比,舌下神经核内抑制ERK或CREB后大鼠自主伸舌力量稍有下降,舌肌训练所致的颏舌肌中枢TMS反应性的增强作用下降,表现为TMS潜伏期延长（P<0.05）;舌肌训练所致的颏舌肌EMG活性、上气道可塌陷性增高作用削弱（P<0.05）。结论:1.我们的研究表明,为期8周的舌肌力量训练可以逐步提高颏舌肌的皮质运动兴奋性和颏舌肌肌电活性,并最终增强大鼠上呼吸道的稳定性。2.BDNF参与介导舌肌训练中颏舌肌中枢调控以及上气道动力学改变。3.BDNF通过Tr KB-ERK-CREB通路介导舌肌训练所致的颏舌肌中枢兴奋性及上气道稳定性的改善。