论文部分内容阅读
在建立简便快速分离麋鹿粪便中产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,CP)方法的基础上,调查麇鹿CP的感染情况,并应用nested PCR法鉴定麋鹿源CP分离株,进而通过毒素的检测鉴定分离株的基因型和产肠毒素情况,对麋鹿产气荚膜梭菌病的防治具有重要意义。试验一麇鹿产气荚膜梭菌分离方法的建立及生化鉴定建立一种简便快速从麋鹿粪样中分离CP的方法,探索了CP在营养琼脂、甘露醇卵黄琼脂和血琼脂平板等培养基上的菌落形态和培养特点,比较了3种可行的分离CP的方法,进而对北京南海子麋鹿苑和江苏大丰麋鹿国家级自然保护区的麋鹿自然感染情况进行了调查,并对分离的菌株进行生化鉴定。结果发现,粪样中的CP在营养琼脂上培养是半透明边缘不整的白色菌落,接种LB培养后,经革兰氏染色阳性的菌落接种甘露醇卵黄琼脂和血琼脂平板,分别出现伴有卵磷脂酶乳光浑浊带的粉红色火山口状菌落和伴有双溶血环的灰绿色勋章样菌落。应用此法检测北京南海子麋鹿苑和江苏大丰麋鹿国家级自然保护区麋鹿粪样发现,阳性率分别为13.04%(3/23)和28.79%(38/132),总感染率为26.45%(41/155)。生化试验结果确认这些分离株均为CP。说明本文建立的麋鹿CP分离鉴定方法简便快速,确实可行；麋鹿CP自然感染率较高,应加强麋鹿产气荚膜梭菌病的流行病学调查及防制。试验二应用半套式PCR法鉴定麋鹿源产气荚膜梭菌根据GenBank公布的CP16S rRNA基因序列设计3条引物,通过引物鉴定、梯度样品的测定及特异性和重复性的研究,建立了16S rRNA基因的nested PCR方法,进而对麋鹿源CP样品进行了检测。结果发现,建立的nested PCR方法对检测CP具有很高的特异性,检测阈值达到10cfu/mL;41份麋鹿CP均为阳性。因此,本文建立的nested PCR方法简便、快速,特异性强,敏感度高,可用于CP的快速检测。试验三麋鹿源产气荚膜梭菌基因型及产肠毒素菌株的鉴定根据GenBank公布的CPβ1、β2、ε、ι和肠毒素(cpe)五种毒素的基因cpb、cpb2、 etx、iA和cpe序列设计五对特异性引物,用PCR方法对分离菌株进行基因分型和产肠毒素菌株鉴定。结果发现,在41个麋鹿CP分离株中,能产生β1和β2毒素的0株,产生ε毒素的5株,产生ι毒素的15株。根据CP的菌型与产毒素的关系,可以判定麋鹿源CP D型5株,占12.20%,E型15株,占36.59%,A型21株,占51.22%。能产生cpe毒素的分离株有15株,占36.59%,包括A型8株,占19.51%,E型7株,占17.07%。说明A型和E型CP是麇鹿感染主要基因型,但仅有少部分的基因型能短时间内产生肠毒素。