论文部分内容阅读
研究目的:近年来,世界范围内肿瘤发病率逐年上升,我国的癌症发病率、死亡率现已居全球第一,其中肺癌是近年来全球死亡率最高的一种恶性肿瘤。环境污染与肺癌的发生有紧密的关联,随着我国环境污染的加重,导致我国肺癌的发病率和死亡率不断上升。目前肺癌的临床治疗有手术治疗、化学治疗、放射治疗和免疫治疗等,但临床上对中晚期的肺癌患者以化疗为主。顺铂作为化疗药物在肺癌的治疗中具有显著效应,但存在副作用较大及耐药等问题。因此,研发出高效低毒、性价比高的新型抗肺癌药物,是十分必要的。多金属氧酸盐（polyoxometalates,POMs,简称多酸）,是一类优秀的金属氧簇化合物,具有一定的抗病毒、抗肿瘤等生物学活性。钒簇多金属氧酸盐（polyoxvanadates,POVs）具有较高的表面电荷和多样化的化学结构,文献报道POVs可对多种肿瘤细胞具有一定的抑制作用。本研究的目的是对我们自主合成的钒簇多金属氧酸盐（VMOP-31）进行抑制A549人非小细胞肺癌细胞的研究,并探讨其抗肿瘤的作用机制。研究方法:根据美国NCI抗癌化合物体外筛选方法来设定VMOP-31的浓度梯度,利用MTT法测定其对A549细胞增殖的抑制作用;选择人正常肺上皮细胞株BEAS-2B,利用MTT法研究VMOP-31对正常细胞的毒性;采用紫外光谱研究VMOP-31和生物大分子的结合作用及其在氨基酸溶液中的稳定性;采用DAPI染色和普通光学显微镜观察细胞的凋亡形态;采用流式细胞仪和Annexin V-FITC/PI染色的方法进一步检测细胞凋亡率;使用流式细胞仪和PI染色来检测细胞周期的变化;采用流式细胞仪及JC-1染色来检测线粒体膜电位的变化;采用流式细胞仪和Fluo-4法来检测细胞内钙离子浓度变化;Western blot检测了同一浓度的VMOP-31（0.3μM）作用于A549细胞的不同时间点上（0 h,4 h,12h,24 h和72 h）和不同浓度的VMOP-31（0μM,0.15μM,0.3μM和0.6μM）作用于A549细胞72 h,A549细胞发生的线粒体细胞凋亡中非Caspase依赖的凋亡通路相关蛋白（PARP,PAR和AIF）和Caspase依赖的细胞凋亡通路相关蛋白（Cyt-c,Caspase-9和Caspase-3）的表达水平。实验结果:钒簇多金属氧酸盐VMOP-31在氨基酸溶液中保持其结构完整性至少96 h;在磷酸盐缓冲液PBS中结构稳定,在280 nm处具有特征性峰,且能够保存结构完整性至少72 h。VMOP-31能与生物大分子ctDNA发生反应,随着ctDNA的加入,吸收峰强度呈现增色效应,且出现了蓝移效应,和血清白蛋白也存在相互作用。VMOP-31对A549细胞的半数抑制浓度IC50值在24 h、48 h和72 h分别为2.6±0.34μM、0.74±0.15μM和0.55±0.12μM。与阳性药物顺铂相比较,VMOP-31具有更显著的抑制作用,且对人正常细胞BEAS-2B具有更低的毒性,因此,VMOP-31比顺铂具有更高的治疗指数。在光镜下观察,VMOP-31可致A549细胞出现凋亡形态,通过DAPI染色荧光显微镜下观察可看出,A549细胞的DNA被破坏,出现明显凋亡的迹象。进一步使用AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡,发现VMOP-31能够显著诱导A549细胞发生凋亡,随着剂量增加凋亡率从17.20%增加到59.51%。VMOP-31可使A549细胞的细胞周期阻滞在G2/M期,随着VMOP-31浓度的增加,在细胞中G0/G1期的细胞百分比从76.42%降低到54.82%,G2/M期的细胞百分比从8.96%增加到22.94%。VMOP-31在0.6μM时,诱导A549细胞Ca2+上升的细胞比例为18.07%,与对照组（8.95%）相比,钙离子浓度上升的比例明显增加。A549细胞经VMOP-31处理后,线粒体膜电位下降细胞的比例为11.18%,与对照组的细胞比例为5.86%相比绿色荧光明显增强。凋亡相关蛋白PAR,PARP,AIF,Cyt-c,Caspase-9和Caspase-3的表达随着VMOP-31浓度的增加而显著升高、且随着VMOP-31处理时间的延长而显著升高。结论:钒簇多金属氧酸盐VMOP-31在不同氨基酸和PBS缓冲液中有较好的稳定性,能与生物大分子ctDNA和血清白蛋白相互作用。对肺癌细胞A549具有明显的抑制作用,且与顺铂相比具有高效低毒的效果。VMOP-31抑制A549细胞增殖的作用机制是通过DNA损伤使A549细胞的细胞周期阻滞在G2/M期及诱导A549细胞发生细胞凋亡。VMOP-31诱导细胞凋亡的作用机制是使细胞内钙离子浓度和线粒体膜电位增加,进而促使Caspase依赖性凋亡通路蛋白Cyt-c、Caspase-3和Caspase-9表达增加,及非Caspase依赖的细胞凋亡通路蛋白PARP、PAR和AIF的表达增加,从而介导A549细胞发生线粒体凋亡,抑制肿瘤细胞生长。本课题对开发新型高效低毒的抗肿瘤药物具有十分重要的意义。