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家蚕（Bombyx mori）二化性品种蚕卵高温光照催青产滞育卵,低温黑暗催青产非滞育卵。有研究表明,不同催青条件下蚕卵的丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）在蛋白质水平上有表达差异,这暗示BmPDK可能在家蚕的滞育机制中扮演重要作用。为此,本论文以二化性家蚕品种“秋丰”为材料,对家蚕不同发育阶段BmPDK基因的表达水平以及催青温度对BmPDK基因表达的影响进行了分析,并对家蚕BmPDK基因进行了原核表达。1、家蚕PDK基因的结构及其分子进化分析采用生物信息学的方法对BmPDK基因及其蛋白结构进行了分析,结果显示BmPDK蛋白质分子质量为46.92 kD、等电点为6.61,无信号肽序列和跨膜结构,氨基酸序列的疏水和亲水区域交错排列,疏水性最小值为-2.5,最大值为1.978。BmPDK的N端部分主要由α螺旋组成;C端部分有α螺旋和β折叠两种结构,其中5个β折叠排列构成一个大折叠面, N端部分与C端部分通过α螺旋连接起来。家蚕BmPDK与果蝇、埃及伊蚊和致倦库蚊等昆虫亲缘关系较近,而与脊椎动物亲缘关系相对较远。2、家蚕二化性品种PDK基因的表达谱及蚕卵催青条件对其表达的影响采用蛾区半分法将二化性品种“秋丰”蚕卵分成2组,分别用高温（25℃）光照和低温（15℃）黑暗催青,分别在戊1胚胎期至蛾期的不同发育阶段制备实验材料,用实时荧光定量PCR的方法分析BmPDK在RNA水平的表达差异,并用SPSS16.0软件对数据进行统计分析。结果显示,BmPDK在己 3、己 4、己 5、蚁蚕及蛾期表达量显著高于其他时期,说明BmPDK在胚胎发育末期及产卵中有重要作用。BmPDK在己5期低温催青的表达量大幅上升,高温的则大幅下降;蚁蚕期则是低温催青的表达量大幅上升,高温的大幅下降;到了2龄期,高温催青和低温催青的表达量均降到极低;蛹期和蛾期的卵巢中,高温催青BmPDK也大量表达。由此可知,催青温度对BmPDK表达的影响主要集中在己5期、蚁蚕期、蛹期和蛾期。3、家蚕BmPDK基因cDNA的克隆与原核表达以“秋丰”蚁蚕总RNA为模板,应用RT-PCR技术扩增BmPDK基因cDNA,通过T-A克隆技术,构建出克隆质粒pMD-18T-PDK。经EcoRI和HindⅢ双酶切后再将该基因重组于原核表达载体pET-28a（+）中,构建出原核表达质粒pET-28a-PDK。将pET-28a-PDK转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析目的蛋白BmPDK的表达形式及最佳诱导浓度、最佳诱导时间。利用Ni2+-NTA树脂对目的蛋白进行纯化,应用Western blot对纯化的目的蛋白进行分析,以鉴定得到的纯化BmPDK蛋白,最后用2,6-二氯吲哚酚法间接测得表达的BmPDK的酶活性。酶切电泳及测序结果显示正确的扩增了BmPDK基因全长。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳结果显示BmPDK蛋白主要以包涵体形式表达,IPTG最佳诱导浓度为0.8 mmol/L,最佳诱导时间为8小时,电泳图上可见约51KDa的特异融合蛋白带。在Ni2+-NTA柱纯化后,用Western blot对目的蛋白进行分析,结果显示目的条带清晰,没有杂带,说明成功构建了原核表达载体pET-28a-PDK,目的条带正确表达。表达的BmPDK有活性,表观一级反应速率常数k = 0.062。本研究结果为进一步研究家蚕BmPDK基因的功能和滞育机理提供了实验数据,也为其他相关后续研究奠定了基础。